MAC感染症におけるエクソソームの役割についての研究

• Project/Area Number: 22K16159
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 牧口 友紀 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (60815843)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2022: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
• Keywords: avium / マクロファージ / エクソソーム / M2 phenotype / マクロファージ分化 / avium感染マクロファージ / MAC感染症

Outline of Research at the Start

難治性呼吸器感染症の一つに非結核性抗酸菌症があり、その菌種のうち、MAC感染症が大半を占める。ただし、その経過には大きな個人差があることが知られ、早期介入や治療強化が必要な患者がどのような者か不明な点が多い。近年、細胞から放出されるエクソソームは細胞間情報伝達に役割を果たしていることが報告され、注目されている。今回、MAC感染症におけるエクソソームの役割について検証する。

Outline of Annual Research Achievements

液体培地におけるavium菌の培養を確立するのに時間を要した（感染実験に使用できる菌量まで増やすのには数週間を要するが、液体培地は栄養豊富のため、わずかな操作ミスによるコンタミを繰り返したため）。また、aviumをマウスマクロファージ（raw264.7)へ感染させた際に上清中に放出されるエクソソームを抽出、回収し、そのavium感染マクロファージ由来のエクソソームがナイーブなマクロファージへどのような影響を与えるか検討する予定だったが、エクソソームの回収量がごく微量であり、（数か月の感染実験でわずか50-70ug)、n=3など、統計処理を行えるような、複数回の実験のための回収には相当の時間を要した。そのため、当初はそれ以外にも多数の実験系を行うはずだった研究計画を変更し、in vitroにおいて、avium感染マウスマクロファージ由来のエクソソームをナイーブなマクロファージへ投与した際、M1、M2いずれにphenotypeを示すようになるか、フローサイトメトリーで測定することにした。M1のマーカーとしてNOS2(PE)、M2マーカーとしてCD206(FITC)を用いた。ナイーブなマクロファージをM2 phenotypeへ分化誘導する能力が予備実験で示され、new findingである。（controlは0.1%、avium感染マクロファージ由来のエクソソーム投与下では2%で、およそ20倍の差である）。絶対的な差は少ないものの、n=3程度まで増やせば、統計学には有意差になると予想され、新規知見と考えるが、エクソソームの回収量が微量であり、現在エクソソーム回収を進めている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

上記結果踏まえ、nを増やすためエクソソーム回収をすすめているが、肝心のM2マクロファージのpostive controlの確立において新たに課題が生じた。文献ではIL-4 20ng/ml投与24時間後に回収、細胞透過処理、固定ののちCD206による染色でpositiveを示すことが報告されているが、これまでの実験でpositive controlがきちんと陽性を示したのは１度だけであった（当初は25%程度陽性を示したが、それ以外は1-5%しか陽性にならず、positive controlとして不満足なものだった）。raw264.7細胞の老化の影響も考え、さまざまな継代数の細胞で比較したが改善しなかった。M2マーカーとしてCD206が適切でない可能性も考え、Arginase-1(AlexFluor488)に変更したが、IL-4投与後に発現増加を確認できなかった。その他、IL-4が失活した可能性も考え倍量投与、かつ投与後48時間までincubation時間を延長したり、考えうるさまざまな方法をためしたが、これまでにM2のpositive controlを確立できず。測定機器の問題も考え、ビーズをCD206(FITC)、Arginase1(AlexFluor488)で染色して測定したところ、ビーズでは陽性シグナルを検出できたため、detectorの問題ではないことが示された。positive controlが確立できないため、微量で貴重なエクソソームを投与する本実験を進められずにいる。

Strategy for Future Research Activity

M2マクロファージのpositive controlについての確立で難渋したという話は探しうる限り見つからない。前任の東北大を含め、さまざなま研究者にも問い合わせたが、経験がある者が見つからず、難航している。CD206の蛍光色素をFITCからPEなどに変更してみるのも一つであるが、これでも結果が出なければmRNAレベルでの検出に切り替える必要があると考える。ただし、mRNAは蛋白への翻訳前のプロセスであるため、IL-4を投与してからのincubation時間の検討から再考する必要があり、これも非常に複雑なプロセスである。
本来は本実験でnを増やしてM2への分化が確実であれば、ナイーブマクロファージと感染マクロファージ由来のエクソソームそれぞれをプロテオミクス解析で内容の比較を実施して研究を終了する予定でいた。