イミキモド誘導性乾癬モデルにおけるストレス応答MAPキナーゼASK1の作用機序

• Project/Area Number: 22K16291
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53050:Dermatology-related
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 長谷川 英哲 東京医科大学, 医学部, 兼任助教 (80935669)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 乾癬 / イミキモド / ASK1 / AhR

Outline of Research at the Start

乾癬は、Th17細胞依存性の慢性炎症性角化症で、近年、p38 MAPキナーゼの阻害が乾癬発症を抑制することが報告されたが、その上流のストレス応答MAPキナーゼASK1の関与は不明である。当研究室では、以前に、p38の関与とは反対に、ASK1はむしろ乾癬発症を抑制し、最近、さらに、予備的実験より、ASK1が角化細胞の分化にも重要な芳香族炭化水素受容体（AhR）と会合し、ASK1欠損CD4+T細胞のTh17/22分化誘導系や角化細胞株へのASK1遺伝子導入により、AhR発現を阻害する可能性を見出した。そこで、本研究では、ASK1による乾癬発症の抑制効果とその作用機序を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

2022年度までの検討より、Apoptosis signal-regulating kinase 1（ASK1）を欠損すると、T細胞での芳香族炭化水素受容体（AhR）発現が増強されIL-22産生が増加し、その結果、角化細胞の増殖が促進され、乾癬が増悪化する可能性が示されたが、ASK1欠損角化細胞でのAhR発現亢進の意味が不明であった。そこで、2023年度は、ASK1による角化細胞の分化誘導におけるAhRの関与について検討した。
① ASK1欠損マウスでの表皮角化細胞の分化と増殖：野生型およびASK1欠損マウスの尻尾の皮膚をDispase処理後、表皮を真皮から剥がしトリプシン処理し、表皮角化細胞を調製した。Ca2+で刺激し分化を誘導し、細胞増殖を比較すると、ASK1欠損では、増殖が亢進し、ウエスタンブロット解析により発現を比較すると、ASK1欠損でAhRや分化マーカーのLoricrinの発現誘導が早く、分化誘導が促進された。
② マウス角化細胞株PAM212での分化と増殖：マウス角化細胞株PAM212細胞にASK1のCRISPR/Cas9ベクターを遺伝子導入し、ウエスタンブロット解析によりその発現の欠失を確認した細胞を作製した。キレート剤処理によりCa2+vを除去したFBSを用いて、Ca2+で分化誘導したところ、上記と同様に、ASK1欠失PAM212細胞で、AhRやLoricrinの発現が亢進している傾向が見られた。
③ 内在性AhR発現への効果： PAM212に、HAタグを付加した野生型ASK-HAおよび恒常的活性型ASK-ΔN-HA、ドミナントネガティブ型ASK1-KR-HAの発現ベクターを遺伝子導入後、ウエスタンブロット解析を行い、ASK1の内在性AhR発現と角化細胞の分化マーカー発現への影響を調べた。その結果、ASK1の発現増強に対して、AhR発現の逆相関が見られた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

p38 MAPキナーゼの阻害が乾癬発症を抑制することが報告されているが、その上流のストレス応答MAPキナーゼASK1は、反対に、乾癬発症を抑制し、その作用機序にAhRが関与していることなどが明らかになってきているので、ほぼ計画の予定通り進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

これまでの結果より、T細胞と同様に角化細胞においてもASK1とAhRの発現が逆相関し、乾癬の発症を調節している可能性が示唆される。そこで、2024年度は、ASK1とAhRの直接の会合の可能性について検討し、その意義や作用機序についても明らかにする。
①再構成系でのASK1とAhRの会合：野生型および欠失型ASK1-HAとAhR-MYC発現ベクターをヒト胎児腎細胞株HEK293T細胞にFugene 6を用いて一過性に遺伝子導入し細胞溶解液を調製し、タグに対する抗体で免疫沈降後ウエスタンブロットにより、両者が会合するか、会合部位についても検討する。
②ASK1と内在性AhRの会合：まず、内在性AhR発現の高いヒト肝癌由来細胞株HepG2細胞に、各種ASK1-HA発現ベクターを一過性に遺伝子導入後、細胞溶解液を調製し、HAタグに対する抗体またはAhRの抗体で免疫沈降反応後、それぞれ反対の抗体でウエスタンブロットを行い、遺伝子導入したASK1-HAに内在性AhRが会合するか検討する。次に、Ca2+で分化誘導したマウス角化細胞株PAM212細胞を用いて、同様に両者の会合を検討する。
③ASK1とAhRの意義：角化細胞における両者の会合の意義は、ASK1発現がないと、AhR発現が増強しその下流のシグナルとしてP450薬物代謝酵素CYP1A1経路を活性し乾癬発症を増悪化し、一方、ASK1発現が強くなると両者が会合しAhR発現が低下し、酸化ストレス応答転写因子NRF2経路を活性化し乾癬発症を改善する可能性を考えている。そこで、野生型PAM212およびASK1欠失PAM212細胞を、イミキモドで刺激し、ウエスタンブロット解析よりCYP1A1とNRF2のどちらが発現増強されるか比較検討する。

Research Products

• [Journal Article] A Promising Needle-Free Pyro-Drive Jet Injector for Augmentation of Immunity by Intradermal Injection as a Physical Adjuvant (2023)
  • Author(s): Jukito Sonoda,Izuru Mizoguchi,Shinya Inoue,Aruma Watanabe,Ami Sekine,Miu Yamagishi,Satomi Miyakawa,Natsuki Yamaguchi,Eri Horio,Yasuhiro Katahira,Hideaki Hasegawa,Takashi Hasegawa,Kunihiko Yamashita and Takayuki Yoshimoto
  • Journal Title: Int J Mol Sci. Volume: 24 Issue: 10 Pages: 9094-9094
  • DOI: 10.3390/ijms24109094
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Potent antitumor effects of the conditioned medium of bone marrow-derived mesenchymal stem cells via IGFBP-4. (2023)
  • Author(s): Furusaka Y, Inoue S, Mizoguchi I, Hasegawa H, Katahira Y, Watanabe A, Sakamoto E, Sekine A, Miyakawa S, Umezu T, Owaki T, Yoneto T, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: in press Issue: 6 Pages: 2499-2514
  • DOI: 10.1111/cas.15789
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Chemical- and Drug-Induced Allergic, Inflammatory, and Autoimmune Diseases via Haptenation. (2023)
  • Author(s): Sakamoto E, Katahira Y, Watanabe A, Furusaka Y, Sekine A, Yamagishi M, Sonoda J, Miyakawa S, Inoue S, Hasegawa H, Yo K, Yamaji F, Toyoda T, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Biology (Basel) Volume: 12(1) Issue: 1 Pages: 123-123
  • DOI: 10.3390/biology12010123
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Protective effects of conditioned media of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous teeth on pressure ulcer formation. (2023)
  • Author(s): Katahira Y, Murakami M, Inoue S, Miyakawa S, Sakamoto E, Furusaka Y, Watanabe A, Sekine A, Kuroda M, Hasegawa H, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Front Immunol. Volume: 13 Pages: 1010700-1010700
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Induction of potent antitumor immunity by intradermal <scp>DNA</scp> injection using a novel needle‐free pyro‐drive jet injector (2022)
  • Author(s): Inoue Shinya、Mizoguchi Izuru、Sonoda Jukito、Sakamoto Eri、Katahira Yasuhiro、Hasegawa Hideaki、Watanabe Aruma、Furusaka Yuma、Xu Mingli、Yoneto Toshihiko、Sakaguchi Naoki、Terai Kazuhiro、Yamashita Kunihiko、Yoshimoto Takayuki
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 114 Issue: 1 Pages: 34-47
  • DOI: 10.1111/cas.15542
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Upregulation of CD86 and IL-12 by rhododendrol in THP-1 cells cocultured with melanocytes through ROS and ATP (2022)
  • Author(s): Katahira Yasuhiro、Sakamoto Eri、Watanabe Aruma、Furusaka Yuma、Inoue Shinya、Hasegawa Hideaki、Mizoguchi Izuru、Yo Kazuyuki、Yamaji Fumiya、Toyoda Akemi、Yoshimoto Takayuki
  • Journal Title: Journal of Dermatological Science Volume: 108 Issue: 3 Pages: 167-177
  • DOI: 10.1016/j.jdermsci.2022.12.012
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A novel coculture system for assessing respiratory sensitizing potential by IL-4 in T cells. (2022)
  • Author(s): Izuru Mizoguchi, Yasuhiro Katahira, Shinya Inoue, Eri Sakamoto, Aruma Watanabe, Yuma Furusaka, Atsushi Irie, Satoru Senju, Yasuharu Nishimura, Shusaku Mizukami, Kenji Hirayama, Sou Nakamura, Koji Eto, Hideaki Hasegawa, Takayuki Yoshimoto
  • Journal Title: ALTEX Volume: - Pages: 204-216
  • DOI: 10.14573/altex.2111181
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] イミキモド誘導性乾癬モデルにおけるストレス応答性MAPキナーゼASK1の役割とその作用機序 (2023)
  • Author(s): 長谷川英哲、渡邉有麻、溝口 出、片平泰弘、関根碧水、山岸美宇、園田寿希心、宮川聡美、前田龍郎、原田和俊、大久保ゆかり、善本隆之
  • Organizer: 第38回日本乾癬学会総会・学術大会
• [Presentation] Conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous teeth inhibit melanogenesis by suppressing Wnt signaling via Wnt5a. (2023)
  • Author(s): Inoue S, Sekine A, Katahira Y, Yamagishi M, Sonoda J, Watanabe A, Miyakawa S, Hasegawa H, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: JSICR/MMCB 2023 Joint Symposium
• [Presentation] Induction of CD8+ T cell-mediated antitumor immunity by intradermal protein injection with a new pyro-derive jet injector. (2023)
  • Author(s): Sonoda J, Mizoguchi I, Katahira Y, Hasegawa H, Yamashita K, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第82回日本癌学会学術総会
• [Presentation] 呼吸器と皮膚感作性物質の識別を可能にするTh2細胞株を応用した改良版2ステップDC/T共培養系の開発 (2023)
  • Author(s): 溝口 出、片平泰弘、長谷川英哲、渡邉有麻、関根碧水、園田寿樹心、山岸美宇、善本隆之
  • Organizer: 第36回日本動物実験代替法学会
• [Presentation] Topical application of Cha-koji, the green tea leaves fermented with Aspergillus lunchuensis ver kawachii kitahara, on the skin promotes acute cutaneous wound healing in mice. (2023)
  • Author(s): Katahira Y, Watanabe A, Miyakawa S, Hasegawa H, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第52回日本免疫学会総会・学術集会
• [Presentation] Protective effect of conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous tooth on the peripheral neuropathy of experimental autoimmune neuritis.JSICR/MMCB 2022 Joint Symposium (2022)
  • Author(s): Hasegawa H, Sakamoto E, Katahira Y, Miyakawa S, Murakami F, Inoue S, Watanabe A, Furusaka Y, SekineA, Owaki T, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: JSICR/MMCB 2022 Joint Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Inhibitory effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on tumor growth and its possible molecular mechanism. (2022)
  • Author(s): Furusaka Y, Katahira Y, Hasegawa H, Umezu T, Mizoguchi I, Yoneto T, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] 骨髄由来間葉系幹細胞の腫瘍増殖の抑制効果とその作用機序 (2022)
  • Author(s): 米戸敏彦、古阪悠馬、片平泰弘、宮川聡美、長谷川英哲、溝口出、善本隆之
  • Organizer: 第30回乳癌基礎研究会
• [Presentation] 化粧品美白成分ロドデノールはメラノサイトでの活性酸素と細胞外ATPの産生を介し樹状細胞での共刺激分子CD86発現を増 (2022)
  • Author(s): 片平泰弘、坂本恵梨、古阪悠馬、渡邉有麻、関根碧水、山岸美宇、園田寿希心、長谷川英哲、溝口 出、善本隆之
  • Organizer: 第35回日本動物実験代替法学会
• [Presentation] Conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous tooth exhibit protective effect on the peripheral neuropathy of experimental autoimmune neuritis. (2022)
  • Author(s): Sakamoto E, Hasegawa H, Katahira Y, Miyakawa S, Watanabe A, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第51回日本免疫学会総会・学術集会