イミキモド誘導性乾癬モデルにおけるストレス応答MAPキナーゼASK1の作用機序

• Project/Area Number: 22K16291
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53050:Dermatology-related
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 長谷川 英哲 東京医科大学, 医学部, 兼任助教 (80935669)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ASK1 / 乾癬 / イミキモド / AhR

Outline of Research at the Start

乾癬は、Th17細胞依存性の慢性炎症性角化症で、近年、p38 MAPキナーゼの阻害が乾癬発症を抑制することが報告されたが、その上流のストレス応答MAPキナーゼASK1の関与は不明である。当研究室では、以前に、p38の関与とは反対に、ASK1はむしろ乾癬発症を抑制し、最近、さらに、予備的実験より、ASK1が角化細胞の分化にも重要な芳香族炭化水素受容体（AhR）と会合し、ASK1欠損CD4+T細胞のTh17/22分化誘導系や角化細胞株へのASK1遺伝子導入により、AhR発現を阻害する可能性を見出した。そこで、本研究では、ASK1による乾癬発症の抑制効果とその作用機序を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

2022年度は、Apoptosis signal-regulating kinase 1（ASK1）と芳香族炭化水素受容体（AhR）発現の相関性とTh17/Th22分化について検討した。
① イミキモド（IMQ）誘導性乾癬のASK1欠損マウスの感受性と野生型でのASK1とAhR発現：5%IMQ含有ベセルナクリームを毎日塗布すると、野生型マウスに比べASK1欠損マウスで乾癬症状が増悪化するが、4日後の野生型およびASK1欠損マウスの皮膚を抗ASK1抗体を用いて免疫組織学的解析を行った。しかし、ASK1の染まりが悪く有棘層かもはっきりしなかった。そこで、次に、その皮膚組織の溶解液をウエスタンブロット解析を行うと、ASK1欠損皮膚では、ASK1とロリクリン発現が低下し、AhR発現が増強されていた。ところが、AhRの下流のシグナルであるシトクロムP450（CYP）1A1とNF-E2 p45-related factor 2 (Nrf2)の発現は、共に減少していた。CYP1A1が増強していれば、乾癬症状増悪化と一致したのだが、その意味はさらに検討中である。
② 野生型およびASK1欠損マウスでのTh17/Th22分化：上記の乾癬を誘導した皮膚のRNAを抽出しRT-qPCR解析を行うと、IL-22やIL-17発現の増強が見られた。そこで、野生型およびASK1欠損マウス由来ナイーブCD4+T細胞を、AhRのリガンドFICZ有無の各種Th22およびTh17分化条件下で固相化抗CD3抗体+抗CD28抗体で刺激すると、ASK1欠損していると、特にFICZ有でのTh22分化条件下でIL-22産生が増加していることが、FACSを用いた細胞内サイトカイン染色解析と培養上清のELISA解析により示された。この時、ウエスタンブロット解析より、ASK1欠損細胞では、AhR発現が高かった。
以上より、ASK1欠損していると、T細胞でのAhR発現が増強されIL-22産生が増加し、角化細胞の増殖が促進され乾癬が増悪化する可能性が示された。ASK1欠損角化細胞でのAhR発現亢進の意味についてはさらに検討中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Apoptosis signal-regulating kinase 1（ASK1）と芳香族炭化水素受容体（AhR）発現の相関性が明らかになってきたので、ほぼ計画の予定通り進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

2023年度：ASK1 は角化細胞でもAhR発現を抑制するかの検討
① ASK1欠損マウスでの表皮角化細胞の分化と増殖：野生型およびASK1欠損マウスの尻尾の皮膚を剥がし角化細胞を調製し、Ca2+で刺激し細胞増殖への影響と、ウエスタンブロット解析によりASK1とAhR発現、角化細胞の分化マーカーの発現を解析する。② マウス角化細胞株PAM212での分化と増殖： CRISPR/Cas9でASK1発現を欠失したPAM212細胞を作製し、野生型PAM212細胞と共に、Ca2+で分化誘導し培養し、増殖とASK1とAhR、各種分化マーカーの発現を調べる。蛋白質合成やプロテオソーム、リソソーム阻害剤存在下で検討し、AhR発現の低下の作用機序を検討する。③ 内在性AhR発現への効果： PAM212に、野生型ASK-HAおよび恒常的活性型ASK-ΔN-HA、および、ドミナントネガティブ型ASK1-KR-HA発現ベクターを遺伝子導入後、ウエスタンブロットを行い、ASK1の内在性AhR発現と、上述の角化細胞の分化マーカー発現への効果を調べる。
2024年度： ASK1による角化細胞分化誘導とAhRへの会合の検討
① ASK1による角化細胞分化誘導におけるAhRの役割：CRISPR/Cas9でAhR発現を欠失したPAM212細胞を作製し、Ca2+刺激やASK1発現ベクターの遺伝子導入による角化細胞の分化への影響を内在性AhR発現の有無で調べる。② 再構成系でのASK1とAhRの会合：野生型および欠失型ASK1-HAとAhR-3xFLAG発現ベクターをHEK293T細胞に遺伝子導入し、タグに対する抗体で免疫沈降後ウエスタンブロットにより、両者の会合およびその部位を調べる。③ ASK1とAhRの会合： PAM212に、各種ASK1発現ベクターを遺伝子導入後、細胞溶解液を免疫沈降反応後AhRの抗体でウエスタンブロットを行い、内在性AhRが会合するか、その会合部位も検討する。次に、Ca2+で分化誘導したPAM212を用い、内在性のそれぞれの分子が会合するか検討する。

Research Products

• [Journal Article] Chemical- and Drug-Induced Allergic, Inflammatory, and Autoimmune Diseases via Haptenation. (2023)
  • Author(s): Sakamoto E, Katahira Y, Watanabe A, Furusaka Y, Sekine A, Yamagishi M, Sonoda J, Miyakawa S, Inoue S, Hasegawa H, Yo K, Yamaji F, Toyoda T, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Biology (Basel) Volume: 12(1) Issue: 1 Pages: 123-123
  • DOI: 10.3390/biology12010123
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Protective effects of conditioned media of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous teeth on pressure ulcer formation. (2023)
  • Author(s): Katahira Y, Murakami M, Inoue S, Miyakawa S, Sakamoto E, Furusaka Y, Watanabe A, Sekine A, Kuroda M, Hasegawa H, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Front Immunol. Volume: 13 Pages: 1010700-1010700
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Upregulation of CD86 and IL-12 by rhododendrol in THP-1 cells cocultured with melanocytes through ROS and ATP (2022)
  • Author(s): Katahira Yasuhiro、Sakamoto Eri、Watanabe Aruma、Furusaka Yuma、Inoue Shinya、Hasegawa Hideaki、Mizoguchi Izuru、Yo Kazuyuki、Yamaji Fumiya、Toyoda Akemi、Yoshimoto Takayuki
  • Journal Title: Journal of Dermatological Science Volume: 108 Issue: 3 Pages: 167-177
  • DOI: 10.1016/j.jdermsci.2022.12.012
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A novel coculture system for assessing respiratory sensitizing potential by IL-4 in T cells. (2022)
  • Author(s): Izuru Mizoguchi, Yasuhiro Katahira, Shinya Inoue, Eri Sakamoto, Aruma Watanabe, Yuma Furusaka, Atsushi Irie, Satoru Senju, Yasuharu Nishimura, Shusaku Mizukami, Kenji Hirayama, Sou Nakamura, Koji Eto, Hideaki Hasegawa, Takayuki Yoshimoto
  • Journal Title: ALTEX Volume: - Pages: 204-216
  • DOI: 10.14573/altex.2111181
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Protective effect of conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous tooth on the peripheral neuropathy of experimental autoimmune neuritis.JSICR/MMCB 2022 Joint Symposium (2022)
  • Author(s): Hasegawa H, Sakamoto E, Katahira Y, Miyakawa S, Murakami F, Inoue S, Watanabe A, Furusaka Y, SekineA, Owaki T, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: JSICR/MMCB 2022 Joint Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Inhibitory effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on tumor growth and its possible molecular mechanism. (2022)
  • Author(s): Furusaka Y, Katahira Y, Hasegawa H, Umezu T, Mizoguchi I, Yoneto T, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] 骨髄由来間葉系幹細胞の腫瘍増殖の抑制効果とその作用機序 (2022)
  • Author(s): 米戸敏彦、古阪悠馬、片平泰弘、宮川聡美、長谷川英哲、溝口出、善本隆之
  • Organizer: 第30回乳癌基礎研究会
• [Presentation] 化粧品美白成分ロドデノールはメラノサイトでの活性酸素と細胞外ATPの産生を介し樹状細胞での共刺激分子CD86発現を増 (2022)
  • Author(s): 片平泰弘、坂本恵梨、古阪悠馬、渡邉有麻、関根碧水、山岸美宇、園田寿希心、長谷川英哲、溝口 出、善本隆之
  • Organizer: 第35回日本動物実験代替法学会
• [Presentation] Conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous tooth exhibit protective effect on the peripheral neuropathy of experimental autoimmune neuritis. (2022)
  • Author(s): Sakamoto E, Hasegawa H, Katahira Y, Miyakawa S, Watanabe A, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第51回日本免疫学会総会・学術集会