骨髄異形成症候群におけるfibrocyteを介した骨髄線維化誘導機構の解析

Research Project

Project/Area Number	22K16315
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
Research Institution	National Defense Medical College
Principal Investigator	前川隆彰防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 緩和ケア室, 講師 (70907055)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000) Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000) Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	fibrocyte / 骨髄異形成症候群 / 患者血清 / MDS92 / multi-cytokine assay / Polgマウス / genotyping / ホモ接合体 / FISH法 / 骨髄線維症 / サイトカイン / SLAMF7
Outline of Research at the Start	血液疾患において骨髄線維化の合併は予後不良の要因であるが、具体的な線維化誘導機序は未だ不明な点が多く、その対処法も確立していない。申請者はfibrocyteという創傷治癒に関与するとされてきた単球由来の細胞に着目し、この細胞が骨髄増殖性腫瘍における骨髄線維化の進展に寄与していることを明らかにしてきた。本研究では、骨髄異形成症候群（MDS）におけるfibrocyteによる骨髄線維化誘導機序の関与を明らかにするため、MDSの腫瘍細胞が fibrocyteの分化経路や機能に与える影響、さらには腫瘍細胞自体がfibrocyteに分化して骨髄線維化を促進している可能性について検証する。
Outline of Annual Research Achievements	本研究では①「MDSの腫瘍細胞が産生するサイトカインがfibrocyteの分化経路に及ぼす作用」、②「MDS症例の末梢血検体及びMDSモデルマウスにおけるfibrocyteの活性化の有無」及び③「腫瘍細胞自体がfibrocyteへと分化して骨髄線維化に寄与している可能性」について検討を加える。上記の①に関しては、MDS患者13例の血清検体を保存した。また、単球からfibrocyteへの分化に関連する14種類のサイトカインを同時に測定できるカスタムパネルを作成した。令和6年度以降はこのパネルを用いて、患者血清の解析を行っていく。さらに、MDS患者の幹細胞から樹立されたMDS92細胞株を譲渡して頂き、培養上清約200mlの保存を行った。この培養上清を用いて健常者の単球の培養実験を行ったところ、通常の培地と比較して単球からマクロファージへの分化が促進され、相対的にfibrocyteの割合は減少した。既報ではM-CSFの投与により単球からマクロファージへの分化が促進されるとされており、上記のLEGENDplexを用いて解析を進めていく方針である ②に関しては、Jackson LaboratoryよりMDSのモデルマウスであるPolgマウスのヘテロ接合体を2ペアずつ4匹購入し、交配を開始した。令和6年度3月時点でホモ接合体のオス7匹・メス5匹とヘテロ接合体のオス8匹・メス11匹を作成した。最終的なRomiplostimの投与実験を行うために、ホモ接合体のメスを投与群5匹、非投与群5匹の計10匹準備することを計画しており、引き続き交配を継続していく。 ③については、FISH法にて検出可能なMDS症例が2, 3例必要と考えられるが、令和6年3月までに集積された13例のMDS症例の中に該当する症例は含まれておらず、研究期間を延長して引き続き症例の集積を継続していく方針である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason Jackson LaboratoryよりMDSのモデルマウスであるPolgマウスのヘテロ接合体を2ペア4匹購入することを計画したが、新型コロナウイルスの影響に伴う発送の遅れなどが相次ぎ、実際に納品されたのは令和4年12月15日となったため、開始時期が半年以上遅延した。また、Jackson Laboratoryの公表しているPolgマウスの遺伝子変異検出用のプライマーを用いてgenotypingを行ったが、ホモ接合体の一部において野生型のバンドが検出される事象が確認されたため、試薬や実験方法等の見直しを行い、令和5年10月20日に再度全個体のgenotypingを実施した。その結果をもとに、再度交配を進めている。また、MDS症例の集積についても目標症例数を30例としているが、令和6年3月時点で13例に留まっており、令和7年度への研究期間の延長が必要と考えられる。
Strategy for Future Research Activity	単球からfibrocyteへの分化に関連するサイトカインとしては、IL-1RA, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12p70, IL-13, IL-18, CXCL1, CCL2, CCL4, CCL22, TNF-α, IFN-γ, M-CSFなどが知られている。本研究では、LEGENDplexというmulti-cytokine assay kitを用いてこれら14種類のサイトカインを同時に測定できるカスタムパネルを作成した。令和6年度以降はこのパネルを用いて、患者血清中およびMDS92細胞株の培養上清中のfibrocyteに影響を与える因子について解析を行っていく。また、MDSのモデルマウスであるPolgマウスについては、同時期に出生したホモ接合体マウスのメスを投与群5匹、非投与群5匹の計10匹準備し、Romiplostimの投与に伴う骨髄線維化や脾腫、貧血の進行などについて評価する。また、可能であればホモ接合体マウス5匹と同週齢のヘテロ接合体マウス5匹の両群に対してRomiplostimの投与を行い、反応性の差異について評価する。現在FISH法によって腫瘍細胞由来のfibrocyteとそれ以外のfibrocyteを判別することを計画しているが、FISH法によって判別可能な染色体異常を持つMDS症例が十分数得られなかった場合、免疫染色など他の方法で腫瘍と非腫瘍を判別する手段を検討しなくてはならなくなる可能性もある。引き続き症例を集積しつつ検討していく。