肝移植におけるsiRNAと機械灌流法を用いたシグナル遮断による虚血再灌流傷害抑制

• Project/Area Number: 22K16436
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 藤好 真人 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (90844720)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2023: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000); Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: 肝移植 / 機械灌流 / 核酸治療 / 虚血再灌流傷害 / 臓器保存

Outline of Research at the Start

虚血再灌流傷害では、虚血により酸素が欠乏し、電子伝達系が停止し代謝基質のバランスが失われ、その後の復温と再酸素化により代謝活性が急激に上昇し、ROS産生、DAMPSの放出、その下流の炎症反応を介して臓器が傷害される。
機械灌流法は再灌流前に電子伝達系を再開させることにより、再灌流時の組織傷害を軽減する。これによりDAMPSの放出は抑制される。
本研究ではsiRNA治療によるDAMPSの発現の直接的な抑制効果を上乗せして、機械灌流法による虚血再灌流抑制効果を強化することにより、グラフト内で始まってしまった虚血再灌流傷害をレシピエント側に波及させることなく終息させる治療法の確立を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

今年度は動物実験モデルの構築を行なった。ここで我々はモデル構築段階における標的遺伝子として、前実験において使用実績があり、移植後のgene silencing効果をレシピエントマウスの血液検査により直接評価することが可能なcoaguration factor VIIを選択した。
本研究における動物実験モデルは、マウス肝移植モデルに機械灌流およびsiRNAのin vivo transfectionを導入したものであり、①ドナーマウス体内においてリポフェクション法によるドナー肝臓へのsiRNAのin vivo transfectionを行う、②摘出したドナー肝臓に対し冷温浸漬法による体外保存を行う、③冷温浸漬保存を行なった後にドナー肝臓に対しhypothermic oxygenated machine perfusion (HOPE法)を行う、④移植前siRNA導入およびHOPE法による機械灌流を施されたドナー肝臓をレシピエントマウスに移植する、という手順で構成されるものである。
我々は、このプロトコルに従って実験手術を行った。モデルの安全性は体外保存時間を最短とするimmediate transplantationモデルで評価し、安定したレシピエントマウスの移植後生存を得た。また、移植前siRNA導入の効果は移植後のレシピエント血液におけるcoagulation factor VIIの測定により行い、十分なレベルの移植後gene silencing効果を確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究における動物実験モデルは手術操作における技術的要求が非常に高いと同時に、移植前siRNA導入に用いる試薬は高価であるため、移植からgene silencing効果の評価までの一連の実験を行い、手術操作の安全性およびsiRNAの導入効率の評価を行い、トラブルシューティングを行うという作業を、同時並行では行わず１例づつ進めてきたため、研究スケジュールにやや遅れが生じたが、高度な研究モデル構築において高いコストパフォーマンスを実現することができた。

Strategy for Future Research Activity

これまではモデルの構築段階であったため、coagulation factor VIIを標的とするsiRNAを用いてきたが、今後はこのモデルにおいてgene silencingの標的遺伝子をHMGB-1として、in vivo transfection、体外浸漬保存、冷温機械灌流を経て移植後にHMGB-1の発現抑制が低下しているかを評価する。
HMGB-1を標的とするsiRNAについて導入条件の確認を行い、HMGB-1の発現抑制効果が確立された後、HMGB-1を標的とするsiRNAの移植前導入群とコントロールsiRNAを導入したコントロール群の間で移植後成績および虚血再灌流傷害の比較を行う。
移植後成績の評価は、レシピエントの術後生存や体重変化などで行い、肝臓グラフトにおける虚血再灌流傷害の評価は、組織学的評価や移植後のレシピエントの血液検査によるグラフト傷害マーカー測定などに基づいて行う。
この動物実験において得られたサンプルを用いてHMGB-1の下流遺伝子の網羅的発現解析を行う。この解析は、移植後成績評価において肝臓グラフトにおけるHMGB-1の抑制により虚血再灌流傷害の軽減効果が確認された場合には、軽減効果の機序解析を目的とする。また、虚血再灌流傷害の軽減効果が確認されなかった場合には、HMGB-1発現抑制の効果を補完する虚血再灌流傷害機序の探索を行い、さらにその機序を新たな治療標的として治療法の開発を検討する。