肝細胞癌におけるEB1とOATP1B3の分子病理学的関連性の解明

• Project/Area Number: 22K16476
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 55020:Digestive surgery-related
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 相山 健 北海道大学, 大学病院, 医員 (50908176)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 肝細胞癌 / OATP1B3 / EB1 / 免疫染色 / ノックアウト細胞株

Outline of Research at the Start

肝細胞癌切除症例においてEB1が予後および再発予測バイオマーカーとして有用であることを報告し、再現性も示した。そして、肝癌細胞株のRNAマイクロアレイ解析でEB1の発現と連動してOATP1B3遺伝子の発現が増減することを発見した。また、OATP1B3はその肝細胞癌治療薬であるLenvatinibが関与するトランスポーターの一つである。本研究では、肝細胞癌においてOATP1B3の担う役割を探求しつつ、EB1とOATP1B3の関連性を臨床検体および肝癌細胞株を用いて解析し、肝細胞癌の進展や薬剤感受性においてEB1とOATP1B3がお互いにどのように関与しているかを解明することを目的としている。

Outline of Annual Research Achievements

臨床検体を用いた免疫染色(免染)は、昨年度倫理委員会の許可がおり、今年度はEB1とOATP1B3の免染についての条件検討を行った。特にOATP1B3の免染については、適した抗体がなかなか見つからず、またポジティブコントロール、ネガティブコントロールがはっきりとせず難渋していたが、免染用のポジティブおよびネガティブコントロールとして細胞株のセルブロックを作製し、なんとか条件検討が終了した。今後は臨床検体を用いて免染を行い、評価し、解析する予定である。 また、先行研究と同様にEB1の免染も行い、OATP1B3との関連性を臨床病理学的観点から確認予定である。
細胞実験については、肝癌細胞株(PLC/PRF/5、HLE、HLF、HuH-7、JHH4、KIM-1、KYN-2、Li-7)のCancer type(Ct) -OATP1B3のmRNAの発現量を確認した。また、先行研究で作製したHuH-7のEB1-Knock Out(KO)株とこれらにEB1を再発現させた細胞株も同様にCt-OATP1B3のmRNA発現量を確認した。上記肝癌細胞株のOATP1B3のタンパクの発現量も確認しようとしたが、Western blotに適した抗体が見つけられず、現在タンパク抽出法から再検討している。 また、CRISPR-Cas9によるOATP1B3-KO株の作製はタンパクの発現が確認できないので断念した。代わりにshRNAによるOATP1B3-knockdown株を作製した。knockdownにより増殖能・遊走能が有意に低下することを確認した。今後は浸潤能や腫瘍形成能などの機能的解析を行う予定である。また、Overexpression株を作成し、それによる増殖能・遊走能・浸潤能等の機能的解析を行う予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本研究のWestern blotあるいは免染に適したOATP1B3に対する抗体がなかなか見つからず、本研究の進行にかなりの影響を及ぼしている。それに伴い、OATP1B3-KO肝癌細胞株の作製を途中まで行っていたが、途中で断念せざるを得なくなり、KO株作製に費やした時間が無駄になってしまったことも影響している。さらに、想定以上にknock down株やOverexpression株の作製にも時間を要しており、OATP1B3の細胞学的、組織学的機能解析に至るまでの過程にかなり苦労している。

Strategy for Future Research Activity

OATP1B3のKO株作製は断念せざるを得なかったが、knock down株作製には成功したので、今後はこの細胞株を起点に抗体の確認や細胞実験を前へと推進していけると考える。また、Overexpression株も完成しつつあるので、それに伴い肝癌細胞株におけるOATP1B3の機能解析が進むと考える。
免染も準備が整いつつあるので、OATP1B3と肝細胞癌切除症例の臨床病理学的因子との関連についても今後解析が進むと考える。EB1の免染も並行して行うことでOATP1B3とEB1の臨床病理学的面での関連性についても検討できると考える。