| Project/Area Number |
22K16492
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
鉾之原 健太郎 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (40876520)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | CRISPR-Cas9 / 大腸癌 / CRISPR/Cas9 / バイオインフォマティクス / バイオマーカー / 薬剤耐性 |
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| Outline of Research at the Start |
大腸癌の治療成績は集学的治療の発達により飛躍的に向上しているが、切除不能進行大腸癌の予後は未だ不良である。治療の中核となる化学療法の発達は目覚ましいものがあるが、経過とともに薬剤耐性を獲得することが問題であり、薬剤耐性機序の更なる解明とそれを標的とした新規治療法の開発が望まれる。本研究では、約2万個の遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9ライブラリーを用いたノックアウトスクリーニングとNGSによる網羅的シークエンスの手法を用いて、大腸癌の薬剤耐性に関連する遺伝子を高精度にスクリーニングすることにより新規治療標的を同定し新規治療法の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
①2022年度に続き、CRISPR Cas9による治療抵抗性大腸癌のゲノムワイド解析の予備実験を遂行した。2023年4月から5月にかけて、大腸癌細胞株(HCT116、DLD-1、SW480)に対して使用する大腸癌治療のキードラッグ(オキサリプラチン、イリノテカン、5-FU)の阻害濃度の検討を行った。6月には、CRISPR Cas9導入のセレクションを行う抗菌薬(Puromycin、Blasticidin)の濃度の検討を行った。7、8月にはHCT、DLD-1、SW480に対してCas9を導入し、ウェスタンブロットを用いてDLD-1、SW480細胞株にCas9が導入できていることを確認した。なお、HCT116細胞株へのCas9の導入は今回はできていなかった。9、10月で、Cas9を導入した大腸癌細胞株にVEGFAノックアウトCRISPRレンチウイルスを導入し、試薬濃度の検討を行った。また、VEGFA遺伝子をノックアウトできていることを確認した。
②予備実験を終え、10月からWhole Human geneを対象としたCRISPRプラスミドの作成を開始し、成功した。11月からは、作成したプラスミドをLenti293T細胞に導入し、レンチウイルスを作成、高いクオリティで成功していることを確認した。12月には、作成したCRISPRレンチウイルスをCas9-SW460細胞株に導入し、抗菌薬セレクションの後、イリノテカン暴露群、コントロール群の2群に分け、それぞれのDNAを抽出した。2024年1月にベクタビルダー社にDNAのNGS解析を依頼し、結果を待っている。2月、3月で5-FU、オキサリプラチンに対しても同様の実験を行い、DNA抽出まで行うことができた。DNAのNGS解析結果を基に、バイオインフォマティクス解析ソフト(MaGECK, PinAPL)を用いて薬剤耐性に関連する遺伝子を特定する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前年度からの遅れ(レンチウイルスを扱うP2実験室を確保するのに時間を要した。さらに、遺伝子組換え新規実験申請の許可が下りたのが2023年2月であり、研究開始に遅延が生じた。)
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| Strategy for Future Research Activity |
DNAのNGS解析結果を基に、バイオインフォマティクス解析ソフト(MaGECK, PinAPL)を用いて薬剤耐性に関連する遺伝子を特定する。
遺伝子の特定後は、対象の遺伝子を複数の大腸癌細胞株でノックアウトまたはノックダウンさせ、再現性の確認を行う。
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