| Project/Area Number |
22K16504
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
大和田 洋平 筑波大学, 医学医療系, 講師 (00819584)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 膵癌 / 3Dオルガノイド / 腫瘍内不均一性 / バイオバンク / 糖鎖 / レクチンマイクロアレイ / 腫瘍不均一性 / レクチン |
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| Outline of Research at the Start |
癌結節は単一な細胞ではなく、複数の異なった性質をもつ不均一な細胞集団から成り、浸潤転移、薬剤耐性などの悪性化に強く関与している。
本研究では、膵癌の不均一性を再現する為に、１患者からの腫瘍を様々な異なる条件で3Dオルガノイド培養し、分化度の異なる腫瘍細胞による3Dオルガノイドライブラリーの構築条件を探索する。続いて、複数の膵がん患者の不均一性を集めた不均一な3Dオルガノイドバンクを構築する。作成したオルガノイドを用いてレクチンマイクロアレイを使った網羅的な糖鎖の探索を行い、細胞最外層を構成する糖鎖層の不均一性解明に挑む。さらに、薬剤感受性試験を行い、個別医療へとつなげる学術的基盤の形成を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
膵癌は固形癌の中で予後不良な難治性悪性腫瘍であり、腫瘍の組織学的及び分子生物学的な不均一性(heterogeneity)が治療抵抗性の一因である上、膵癌研究を複雑化している。これらheterogeneityを反映した実験モデルは未だ確立した手法が無い。3Dオルガノイド培養はSatoらが腸管上皮幹細胞培養技術(腸管オルガノイド培養)を開発して以降(Sato T et al, Nature. 2009)、従来の2D平面培養系、異種 移植モデルにかわる新たな培養法として期待されている。一方、膵癌3Dオルガノイドでは培地などの培養条件に依存したselectionにより、患者本来の heterogeneityが失われている可能性があり培養方法の改良が必要と考えた。
オルガノイドは培地に含まれるniche factor依存性に増殖、形態学的変化を起こす事が知られており、培地の改良を検討した。まず当研究室における膵切除検体 を用いて、ライブラリーを作成、遺伝子変異、発現、糖鎖発現を網羅的に解析し各細胞集団のプロファイリングを行う。同時に初代培養から様々な因子を培地に添加し、増殖性、形態学的変化を観察する。因子の添加群、未添加群における遺伝子発現、糖鎖発現を比較検討し、因子が培養に与える影響を考察する。既に我々はこれまでに膵癌オルガノイドのバンク化に成功しており、計30例以上のヒト膵癌3Dオルガノイドの作成、冷凍保存が可能な状態である。さらに、同一患者から複数の種類のオルガノイド作成を行い、膵癌腫瘍のheterogeneityを反映したオルガノイド作成を目的としたニッチ因子の探索のため、複数のニッチで培養・検討を行った。ニッチXの添加あり、添加なしでそれぞれ培養を行い、異なるpopulationの抽出に成功した。合わせて、遺伝子変異と糖鎖発現の相関関係についても検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2022年5月から2024年3月までに計40症例の膵切除検体から計35種類のオルガノイド樹立に成功した。樹立当初からそれぞれのオルガノイドにおいてニッチ (X,Y,Z...)を添加した群と添加していない群の2群を作成し、その後の2群における変化を評価した。評価項目は培養速度、形態、遺伝子発現、糖鎖発現、薬剤 耐性である。方法として、形態評価はオルガノイドを固定したFFPE切片を作成して免疫染色を行い、さらにマウスモデルを作成し組織像を評価した。 遺伝子発現では筑波プレシジョンメディシンセンター協力のもと、次世代RNAシーケンスを行う。その結果得られたデータを元に、再現性を確認するため、qPCR での発現実験を行う。
樹立時からニッチXを添加したものとそうでないものとではいくつかの症例において異なる分子サブタイプのものが樹立された。その中には形態的、遺伝子変異として明らかに異なるものも確認され、ニッチXを添加したものは5-FUに対して耐性を持つ傾向があった。細胞が集簇した管腔構造を欠いたSolidな形態のオルガノイドは原発腫瘍の低分化な組織を反映しており、その糖鎖発現を調べたところフコシル化に関わる糖転移酵素が低下しており、シアリル化に関わる糖転移酵素の発現が上昇していることが明らかとなった。遺伝子変異と糖鎖発現の関係についてもオルガノイドライブラリーを用いて網羅的に解析を行い、Journal of Oncologyに報告した。
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| Strategy for Future Research Activity |
異なるニッチを用いてオルガノイドを樹立することで形態学的、遺伝学的にも違うものが樹立し得ることはすでに論文として報告した。今後はvitroからvivoまでの実験をさらに進めていくことで再現性を確認する。
現在我々は作成したオルガノイドをまとめてbulkとしてRNAや蛋白を抽出しているが、昨今発展が著しい空間オミクス解析を行う方針である。原発腫瘍及びオルガノイドの空間オミクス解析を取り入れることでニッチで樹立されたオルガノイドの起源にまで迫ることができると考える。
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