膵癌に於ける細胞接着因子クローディン7の分子生物学的役割と革新的治療の開発

• Project/Area Number: 22K16546
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 55020:Digestive surgery-related
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 奥井 紀光 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (60648864)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: クローディン７ / 膵癌 / 肝転移 / 上皮間葉系転換 / Claudin7

Outline of Research at the Start

細胞間結合タンパクのクローディン（CLDN）が、転移の前段階である上皮間葉系転換（EMT）に関連する可能性は高い。先行研究では高悪性度の膵癌細胞株でCLDN7の高発現を確認しており、臨床上の膵癌急性増悪にCLDNが関わる可能性がある。本研究は、CLDN7がもつ膵癌転移、膵癌増悪シグナルに対するメカニズムを明らかにし、新たな治療標的分子の解明を行うことを目標とする。具体的には、膵癌の進展においてCLDN7の細胞悪性度に関わる分子生物学的役割を、EMT、細胞増殖シグナル、細胞周期の側面から明らかにする。また動物モデルを用いて、CLDNノックダウン膵癌細胞株の増殖抑制、化学療法抵抗性改善を検討する。

Outline of Annual Research Achievements

膵癌は腹部に発生する固形悪性腫瘍のうち最も悪性度が高い。局所進行膵癌の生存期間中央値は1年以下、遠隔転移を認める症例では3－6ヶ月と燦々たる状況である。FOLFIRINOX療法や分子標的薬剤を始めとする新規化学療法により生存期間の延長が得られているが治療効果はいまだ限定的で、膵癌に対する新たな治療標的分子の特定は急務である。肝転移を含む遠隔転移は膵癌の予後を規定する最大の因子である。化学療法施行中においても多臓器転移の出現や転移巣の急速増大などの急性増悪をしばしば経験する。血行性転移は原発巣における細胞相互の接着が解離→細胞外基質を分解する浸潤→血管内への接着・侵入→標的臓器への生着と増殖といった多段階のステップを経ると考えられており、中でも細胞間接着は転移機構の制御のキーとなる。
近年、細胞間結合タンパクの一種であるクローディン（Claudin: CLDN）が種々の癌の増殖シグナル、転移機構に関与する可能性が示されているが、膵癌における機能は未解明である。膵癌の主たる再発形式である肝転移は、膵癌患者の治療成績を左右し、転移機構や抑制法の解明は社会からの高い要求がある。細胞接着因子であるCLDNが、転移の前段階である上皮間葉系転換（EMT）に関連している可能性は高い。先行研究では高悪性度の膵癌細胞株においてCLDN7の高発現を確認しており、臨床上の膵癌急性増悪にCLDNが関わっている可能性がある。本研究は、特にCLDN7がもつ膵癌転移、増悪シグナルに対するメカニズムを明らかにし、難治癌の代表格である膵癌に対して新たな治療標的分子の解明を行うことを目標とする。具体的には、膵癌の進展においてCLDN7の細胞悪性度に関わる分子生物学的役割を、EMT、細胞増殖シグナル、細胞周期の側面から明らかにする。また動物モデルを用いて、CLDNノックダウン膵癌細胞株の増殖抑制、化学療法抵抗性改善を検討する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト膵癌細胞株(MIA PaCa-2) から悪性度の異なるいくつかのクローン集団を分離した。悪性度の高いクローン細胞集団は、細胞形態が紡錘状に変化し、高い細胞増殖能を認めた。当該クローンの網羅的遺伝子解析を行うと、CLDNファミリーの中でも特にCLDN7が高発現であることが明らかとなった。CLDN7は大腸癌、肺癌では低発現が悪性度に寄与するとされるが胃癌では逆の報告があり、癌腫により見解は一定しない。CLDN7が膵臓癌悪性化のキーとなる因子であるという仮説のもと、機能解析を開始した。先行研究では、CLDN7は複数のヒト膵癌細胞株で高発現していた。特にCLDN7高発現クローン集団は高い細胞増殖能を示した。さらにCLDN7高発現細胞は動物実験モデルにおいて腫瘍の急速増大を認めた。一方で、siRNAによるCLDN7のノックダウンにより細胞増殖が有意に抑制され、CLDN7が細胞増殖を促進させる因子であることが明らかになった。
膵癌細胞におけるCLDN7のEMT、細胞増殖シグナルに及ぼす影響を分子生物学的に解析し、CLDN7の膵癌の発育伸展・転移浸潤における作用と分子メカニズムを明らかにすることで革新的治療標的分子を確立することを目指した。CLDN7は小腸粘膜に広く高発現していることが知られ、生体でのCLDN7ノックダウンは小腸への重大なダメージが懸念される。しかしながら膵臓癌の治療戦略を検討するうえで抗癌剤耐性や転移浸潤能の亢進機序の解明とその制御は急務の課題であり、CLDN7の分子生物学的解明により得られる意義は極めて大きい。CLDN7の新規治療標的分子としての可能性を確立出来れば、その先に抗体治療への応用も期待される。これまでにCLDN7高発現クローン集団のゲムシタビンへの強い薬剤耐性を確認した。

Strategy for Future Research Activity

複数のヒト膵臓癌細胞株（Panc-1, MIA Paca-2, Capan-2, BxPC-3, AsPC-1）を用いて、CLDN7強発現細胞株とCLDN7ノックダウン細胞株に対してRNAシークエンスを施行して、細胞増殖シグナルやEMT関連タンパクの発現を網羅的に解析する。CLDN7阻害が細胞に与える影響を確認する。
RNAシークエンスにおけるパスウェー解析で同定した細胞増殖シグナルに関して、ヒト膵癌細胞株を用いて、CLDNノックダウンによる影響を確認する。CLDN7ノックダウンによる細胞増殖に関与する転写因子NF-kB, STAT3, Erk 1/2, Aktの活性化阻害効果を検討する。CLDN7ノックダウン細胞の細胞周期解析にてG1アレスト及びその結果として生ずるG1/Sブロックが誘導されることは確認している。阻害効果はELISA法にて定量的に評価する。細胞増殖因子の評価は以下の解析法で行う。タンパク質：アポトーシス (Cleaved caspase-3, -8, -9, Bcl-2, Cytosolic cytochrome c)、細胞周期 (p53, p21, cyclin D1, C-myc)、血管新生 (VEGF)、浸潤・遊走 (MMP-9, ICAM-1, VCAM-1)。アポトーシスはFACS（Annexin V/FITC assay）、細胞周期停止効果（Cell cycle analysis）、細胞増殖抑制効果（MTT assay）にてそれぞれ行う。
CLDN7ノックダウンによるEMTの抑制効果を検討する。ヒト膵臓癌細胞株に対し、shRNAを用いてRNA干渉し、蛋白発現が低下することを確認する。EMTはMigration a、 scratch assayに加え、EMTマーカー(Vimentin, a-SMA, E-cadherin)の 蛋白定量および遺伝子発現を測定する。さらに、手術検体より正常膵組織および膵癌組織のプレパラートを作成し、CLDN7による免疫組織染色を行う。膵管上皮、腺房細胞、癌組織へのCLDN7の分布を染色強度、陽性細胞数から層別化して、年齢、性別、腫瘍マーカー、Tステージ、細胞分化度、脈管侵襲の有無、予後などの臨床病理学因子と比較検討する。