TIGITノックアウトヒトNK細胞を用いた膠芽腫に対する新規治療法の開発

• Project/Area Number: 22K16667
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56010:Neurosurgery-related
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 森本 尭之 奈良県立医科大学, 医学部, 研究員 (20865563)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000); Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
• Keywords: 膠芽腫 / NK細胞 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / TIGIT

Outline of Research at the Start

膠芽腫(glioblastoma、以下GBM)は最も一般的で悪性度の高い原発性脳腫瘍の一つである。
標準治療を行っても全生存期間は2年に満たず、新規治療法の開発が期待される。その中でもわれわれはNatural Killer細胞を用いた免疫療法に着目している。今回の研究では、ゲノム編集技術を用いてチェックポイント受容体の一つであるT cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains (TIGIT) 遺伝子をノックアウトしたヒトNK細胞を誘導し、各種実験モデルを用いて抗腫瘍効果を検証する。。

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、チェックポイント受容体であるTIGITをノックアウトしたヒトNK細胞を誘導し、各種モデルを用いたGBMに対する抗腫瘍効果の増強を示し、臨床応用に寄与できる詳細な細胞特性を明らかにすることで、NK細胞を用いたGBMに対する新規免疫治療法の確立の土台を形成することである。
2022年度には、TIGIT KO NK細胞を作成すべく、CRISPR/Cas9の配列を決定し、実際にin vitroにてゲノム編集NK細胞を確立する必要があった。IDT社のWebサイトにてsingle-guide RNA(sgRNA)を設計する。TIGIT遺伝子を切断する標的配列を設計し、細胞内の非相同末端結合を利用した修復を誘起する。遺伝子ノックアウト効率については設計したCRISPR配列によって違いが生じることを我々は経験しており、中には遺伝子をノックアウトできない領域も存在する可能性も想定される。このため少なくとも2つ以上の位置でCRISPR配列を設計するものとした。CRISPER配列として、3つを設定することができ、いずれも違ったexonに存在することを確認できた。これらのCRISPRを用いて、ヒト末梢血から誘導したNK細胞に対して電気穿孔法でCRISPR/Cas9を誘導し、TIGITを発現する遺伝子のノックアウトを行い、ゲノム編集後のNK細胞のTIGIT発現やその他のcheck point recepterの発現を確認することが目的です

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2022年度には、TIGIT KO NK細胞を作成すべく、CRISPR/Cas9の配列を決定し、実際にin vitroにてゲノム編集NK細胞を確立する必要があった。IDT社のWebサイトにてsingle-guide RNA(sgRNA)を設計する。TIGIT遺伝子を切断する標的配列を設計し、細胞内の非相同末端結合を利用した修復を誘起する。遺伝子ノックアウト効率については設計したCRISPR配列によって違いが生じることを我々は経験しており、中には遺伝子をノックアウトできない領域も存在する可能性も想定される。このため少なくとも2つ以上の位置でCRISPR配列を設計するものとした。CRISPER配列として、3つを設定することができ、いずれも違ったexonに存在することを確認できた。

Strategy for Future Research Activity

現在、TIGIT KO NK細胞を作成するべく、複数のCRISPR配列をデザインした。
今後、ヒト健常人血液からT細胞を除去した末梢血単核細胞を分離し、IL-2/IL-18の存在下で拡大培養を行う。培養7日目のNK細胞にCRISPR配列とCas9蛋白をNucleofectorによる電気穿孔法で導入する。遺伝子導入後に、自己血漿、IL-2含有AIM-V培地でさらに7日間培養する。増幅倍率は14日間で50倍以上を目標とする。
次に、TIGIT、その他の細胞表面レセプターの発現を各種抗体とフローサイトメータ (BD社) を用いて解析する。DNA抽出キットを用いてDNAを単離し、polymerase chain reaction (PCR)で標的配列周辺のDNAを増幅する。増幅後のPCR産物を再び変性とアニーリングさせ、T7 Endonuclease I によりミスマッチ配列を切断し、電気泳動を行うことでTGIT遺伝子の破壊効率を確認する。また、RNA抽出キット(QIAgen社)を用いてRNAを単離し、Clariom S (Thermo社)を用いたマイクロアレイ解析を理研ジェネシス社等の外部委託施設に依頼する。その後、Transcriptome Analysis Console (TAC) software (Thermo社)を用いて解析を行う。また、enrichment解析により、NK細胞の機能解析を行う。これらの検証により、TIGIT関連遺伝子と非関連遺伝子の発現変化を詳細に把握でき、ゲノム編集の質を包括的に評価できる。これによりがん化などの潜在リスクも評価できる可能性があり、臨床応用に向けて、その安全性が推定できる。