| Project/Area Number |
22K16667
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 56010:Neurosurgery-related
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
森本 尭之 奈良県立医科大学, 医学部, 研究員 (20865563)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
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| Keywords | 膠芽腫 / NK細胞 / TIGIT / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Research at the Start |
膠芽腫(glioblastoma、以下GBM)は最も一般的で悪性度の高い原発性脳腫瘍の一つである。
標準治療を行っても全生存期間は2年に満たず、新規治療法の開発が期待される。その中でもわれわれはNatural Killer細胞を用いた免疫療法に着目している。今回の研究では、ゲノム編集技術を用いてチェックポイント受容体の一つであるT cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains (TIGIT) 遺伝子をノックアウトしたヒトNK細胞を誘導し、各種実験モデルを用いて抗腫瘍効果を検証する。。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、チェックポイント受容体であるTIGITをノックアウトしたヒトNK細胞を誘導し、各種モデルを用いたGBMに対する抗腫瘍効果の増強を示し、臨床応用に寄与できる詳細な細胞特性を明らかにすることで、NK細胞を用いたGBMに対する新規免疫治療法の確立の土台を形成することである。
2023年度には、、ヒト健常人血液からT細胞を除去した末梢血単核細胞を分離し、IL-2/IL-18の存在下で拡大培養を行った。培養7日目のNK細胞にCRISPR配列とCas9蛋白を
Nucleofectorによる電気穿孔法で導入した。遺伝子導入後に、自己血漿、IL-2含有AIM-V培地でさらに7日間培養した。増幅倍率は14日間で50倍以上を目標とし、達成された。次に、TIGIT、その他の細胞表面レセプターの発現を各種抗体とフローサイトメータ (BD社) を用いて解析した。TIGIT以外の活性型・抑制型受容体の発現に明らかな変化はなかった。DNA抽出キットを用いてDNAを単離し、polymerase chain reaction (PCR)で標的配列周辺のDNAを増幅する。増幅後のPCR産物を再び変性とアニーリングさせ、T7 Endonuclease I によりミスマッチ配列を切断し、電気泳動を行うことでTGIT遺伝子の破壊効率を確認し、良好なノックアウト効率を認めた。同時に明らかなoff target効果は認めなかった。また、RNA抽出キット(QIAgen社)を用いてRNAを単離し、Clariom S (Thermo社)を用いたマイクロアレイ解析を理研ジェネシス社等の外部委託施設に依頼した。その後、Transcriptome Analysis Console (TAC) software (Thermo社)を用いて解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト健常人血液からT細胞を除去した末梢血単核細胞を分離し、IL-2/IL-18の存在下で拡大培養を行った。培養7日目のNK細胞にCRISPR配列とCas9蛋白を
Nucleofectorによる電気穿孔法で導入した。遺伝子導入後に、自己血漿、IL-2含有AIM-V培地でさらに7日間培養した。増幅倍率は14日間で50倍以上を目標とし、達成された。次に、TIGIT、その他の細胞表面レセプターの発現を各種抗体とフローサイトメータ (BD社) を用いて解析した。TIGIT以外の活性型・抑制型受容体の発現に明らかな変化はなかった。DNA抽出キットを用いてDNAを単離し、polymerase chain reaction (PCR)で標的配列周辺のDNAを増幅する。増幅後のPCR産物を再び変性とアニーリングさせ、T7 Endonuclease I によりミスマッチ配列を切断し、電気泳動を行うことでTGIT遺伝子の破壊効率を確認し、良好なノックアウト効率を認めた。同時に明らかなoff target効果は認めなかった。また、RNA抽出キット(QIAgen社)を用いてRNAを単離し、Clariom S (Thermo社)を用いたマイクロアレイ解析を理研ジェネシス社等の外部委託施設に依頼した。その後、Transcriptome Analysis Console (TAC) software (Thermo社)を用いて解析を行った。他にもGSEA softwareを用いてenrichment解析を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずは、in vitroで膠芽腫細胞株に対して抗腫瘍効果を増強するかの確認を行うため、Real time cell analyzerを用いて、膠芽腫細胞株の増殖抑制効果について検討を行う。さらに、我々が樹立している3D spheroid modelに対しても抗腫瘍効果の増強をもたらすかについて解析を行う。すでに我々が報告しているこのモデルは治療抵抗性が高くなっているが、我々の樹立したヒトNK細胞はこのモデルに対しても抗腫瘍効果を示した。こちらに対してTIGIT KO NK細胞の抗腫瘍効果を解析するため、同様にFlow cytometryを用いたアポトーシス解析を行う。これらの実験から、TIGIT KO NK細胞はmock NK細胞と比較し、膠芽腫細胞株から樹立した2D, 3D modelに対して抗腫瘍効果の増強をもたらすかについて検討できる。さらに重度免疫不全マウスを用いたxenograft modelを使用し、生存期間の解析も行う。
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