cfDNAを用いる神経膠腫liquid biopsyの発展

Research Project

Project/Area Number	22K16690
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 56010:Neurosurgery-related
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	藤岡寛九州大学, 大学病院, 助教 (10914252)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000) Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Keywords	liquid biopsy / MLPA / cell free DNA / glioma / glioblastoma / liquid iopsy
Outline of Research at the Start	神経膠腫の時間的空間的不均一性の克服にはliquid biopsyが大きく寄与すると予想される。神経膠腫において髄液中cell free tumor DNAが検出できることはわかってきた。しかし現段階では採取できるDNA量が極微量であることで網羅的な解析が可能な症例は限られ、髄液採取よりもより侵襲性の低い血液では感度が十分ではない。本研究はより高感度なassay開発による神経膠腫由来の血漿ctDNAの検出、髄液ctDNA増幅による網羅的解析方法の開発を遂行し、神経膠腫liquid biopsyの臨床での実用性を向上させる。
Outline of Annual Research Achievements	同意を得られた神経膠腫患者の髄液/血液を収集し、cell free DNAの抽出をおこなった。さらにdigital PCR他の検査方法でcfDNAの解析を継続した。digital PCRによる解析に関しては2022年9月脳神経外科学会総会にて　「Diffuse gliomaに対する髄液中cell free DNAを用いたliquid biopsyの現状と課題」として報告した。また、髄液中のcf DNAを利用しMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA)法でglioblastomaのcopy number alternationが判定可能であることを世界で初めて報告した(Neuro-oncology advance. 2022:DOI: 10.1093/noajnl/vdac178)。これはNext generation sequencingより安価でdigital PCRよりも多くのターゲットの解析を可能な、よりアクセスしやすい新しいliquid biopsyの手法を提案するものである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の予定通り、髄液を用いたliquid biopsyにおいてMLPA法の有用性を証明することができた。髄液中cell free DNAの増幅に関してはいくつかの手法で増幅を行ったが、目的とした領域の長さをもつcell free DNAの増幅には至っておらず、また増幅後のcfDNAに対しdigital PCR反応の条件検討を行なっている。新たなdigital PCRの手法の検討に関しては現在使用しているdigital PCR以外の機器のdemonstrationを３種類行い、性能の比較検討を行なっており概ね現行のものよりも性能の改善が得られていることを確認しており、実際の使用に向けて導入の検討を行なっている。cell free DNAのメチル化解析に関しては関しては提出方法を検討中である。
Strategy for Future Research Activity	MLPA法によるliquid biopsyの手法を拡張し、copy number alternation以外の遺伝子変異検出を検討する(point mutationやfusionなど)。引き続き髄液cell free DNAの増幅の検討を行い、dPCRなどの感度上昇を目指す。新たなdigital PCRを用いて再検討を行い、血漿cell free DNAからのcirculating tumor DNAの検出を目指す。 DNA増幅の条件検討が解決すればcell free DNAのメチル化解析検討を行う。