| Project/Area Number |
22K16692
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 56010:Neurosurgery-related
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
山下 真治 宮崎大学, 医学部, 講師 (40468046)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | vasculogenic mimicry / tube formation / statin / glioma / 血管擬態 / オルガノイドモデル / tube formation assay / スタチン / Vascular mimicry / Glioblastoma / Bevacizumab |
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| Outline of Research at the Start |
悪性の原発性脳腫瘍である神経膠腫に対し、血管新生阻害剤の有効性が報告されているが、抵抗性の獲得が問題となり、十分な治療効果を得られていない現状がある。近年、腫瘍由来の血管内皮細胞（血管擬態: Vasculogenic mimicry (VM)）が治療抵抗性に関与する事が報告され、抵抗性克服に関する重要なターゲットと認識されているが、機序解明が進んでおらず、未だ抵抗性克服には至っていない。
本研究は、微小環境を反映するグリオーマオルガノイドモデルを用い、細胞の不均一性を加味したシングルセル解析を行う事で、VMの機序を解明する事を目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は膠芽腫等の悪性脳腫瘍で認められる、血管新生阻害剤の耐性に寄与する血管擬態（VM ; vasculogenic mimicry)の形成機序を解明することをその目的とする。実験手法として、膠芽腫の組織検体より採取した細胞を用いオルガノイドモデルを樹立し、同腫瘍塊内に存在するVMの形成に重要と考えられている GSC(glioma stem cell)を蛍光物質でマークして、HUVEC細胞にて作成した血管内皮モデルへの遊走、血管構造の形成を観察することで機序解明を進める事を計画している。
現時点でも、オルガノイドモデルが安定した形で作成できておらず、計画した解析が行えていない状況にある。そこで、市販の膠芽腫細胞株を使ってtube formation assayを行うことで、VMの機序解明と阻害効果を有する実用的な薬剤の発見に関する検討を行っている。
市販化されている膠芽腫の細胞株の解析から、U87MG, U251細胞株がTGF-βを強く発現しており、かつ同assayにてtubeを形成することが認められた。これら細胞株にTGF-βを添加した場合、tube形成能が向上し、TGFβR1/2阻害剤を用いることでtube形成能が抑制されたことからTGF-βのシグナル経路がVM形成に強く関連している事が推測できた。そこで、TGFβ経路の阻害作用を有するスタチン（シンバスタチン）に着目し、tube形成能に対する効果を検証した。結果、スタチンはTGFβのシグナル伝達を阻害し、tube形成を有意に阻害することが確認できた。同結果を踏まえ、vivoの実験系にてスタチンの血管新生阻害剤の耐性克服に関する検討を計画している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の解析における新規性の高い研究手法として、オルガノイドモデルを用い微小環境を可能な限り実験系に再現することで、真の血管擬態の機序解明を行うことであるが、現時点で安定したオルガノイド作成が行えていない状況にある。培養条件を検討し、いくつかの腫瘍検体を用い作成を試みるも、腫瘍組織の継代が行えず、予定していた実験系を構築するに至っていない現状がある。
そこで、市販の膠芽腫細胞株、当施設にて樹立した細胞株を用い、tube formation assayを用いた血管擬態の機序解明、阻害効果を有する薬剤の発見に関する研究に注力している。
現在、膠芽腫の細胞株（U87MG, U251）にてtube形成が認められること、これらの細胞株がTGF-βを強く発現しており、これを添加するとtube形成能が高まり、TGFβR1/2阻害薬にて同シグナル伝達を抑制するとtube形成が阻害される事を確認している。更に同シグナル伝達の阻害効果を有するシンバスタチンを用いることで、tube形成能を抑制する事が確認できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
オルガノイドモデルの作成には現状克服すべき問題が多く、継続してその作成に尽力していくが、現在注力しているスタチンのVM阻害効果に関する研究を主に推進していく方針でいる。
in vitroにてstatinのVM阻害効果が確認できたことから、in vivoにてその検証を行っていく。膠芽腫細胞株（U87, U251）を用いたxenograft modelを作成し、シンバスタチンとベバシズマブ（抗VEGF抗体薬）との相乗効果につき検証する。シンバスタチンによるVM阻害効果が認められた場合、マウスの生存期間延長に加え、組織学的にも血管擬態が消失することが予想される。ここで得られた腫瘍組織を用い網羅的遺伝子解析を行う事により、VMの機序解明に関する新たな知見が得られるものと考えられる。
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