メカノレセプターTRPV4による椎間板変性に対する治療アプローチ

• Project/Area Number: 22K16743
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56020:Orthopedics-related
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 武岡 由樹 神戸大学, 医学部附属病院, 特命助教 (30943592)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: TRPV4 / 椎間板髄核細胞 / オートファジー / 細胞外基質代謝 / 椎間板変性 / 細胞外基質

Outline of Research at the Start

腰痛の主たる原因となる脊椎椎間板変性は、現在でも有効な治療法が確立していない。椎間板内部は高静水圧環境にあり、日常の体動や姿勢の変化により静水圧も変化することが知られている。TRPV4は浸透圧センサーとして同定されたチャネル型レセプター（主にCa2+）で、椎間板では細胞外基質や炎症系サイトカインとの関与が報告されているが、その働きは十分解明されていない。今回、TRPV4の活性化が椎間板内恒常性維持に寄与していると仮説を立て、TRPV4の椎間板内での役割を明らかにし、治療ターゲットとしての将来的な臨床応用に向けて、細胞実験と動物実験を計画した。

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、ラット椎間板においてTransient receptor potential vanilloid-4 (TRPV4)の抑制および活性化が恒常性維持、すなわちオートファジーと細胞外基質代謝に与える影響を明らかにすることである。2022年度はラット尾椎椎間板髄核細胞を用いて細胞実験を行った。
機能欠失実験ではTRPV4 siRNAをリバーストランスフェクション法で細胞に導入し、炎症刺激(IL-1β添加）条件下で、タンパクを抽出してオートファジーマーカーや細胞外基質同化因子・異化関連因子をウェスタンブロット法で評価した。TRPV4の抑制により、オートファジーの有意な抑制（p62/SQSTM1の低下とLC-IIの増加）と、細胞外基質同化因子（Aggrecan, Collagen type II, TIMP1, TIMP2）の有意な減少、異化関連因子（MMP3, MMP13）の有意な増加を認めた。また、TUNEL染色を用いた細胞生存率の評価では、TRPV4抑制により細胞生存率の有意な低下を認めた。
機能獲得実験では、TRPV4アゴニストを添加して細胞を培養し、同様に炎症刺激条件も設けて、オートファジーと細胞外基質の評価をウェスタンブロット法で行った。炎症刺激下において、アゴニストによるTRPV4の活性化によりオートファジーマーカーの有意な増加を認め、細胞外基質同化因子の有意な増加と、異化関連因子の有意な低下を認めた。さらに、アポトーシスマーカーを評価し、アポトーシスの抑制（Cleaved PARP, Cleaved Caspase 9の低下とPARPの増加）が示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定では、1年目は細胞実験を中心に行う計画であった。現在までに、計画していた機能欠失実験、機能獲得実験をほとんど完了しており、計画通りであると考えている。

Strategy for Future Research Activity

細胞実験においては、ウェスタンブロットによるタンパクの評価を追加する。
さらに動物実験を開始する。我々の研究室で過去に開発した、ラット尾椎静的圧迫モデルを用いて、機能欠失・獲得実験を行う。評価法はX線学的評価（椎間板高の計測）、組織学的評価（サフラニンO染色）、蛍光免疫染色である。動物モデルは最長56日飼育する予定であり、細胞実験よりも時間を要する見込みである。

Research Products

• [Presentation] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) knockdown decreases extracellular matrix synthesis via autophagy suppression in rat intervertebral disc (2023)
  • Author(s): Tomoya Matsuo, Yoshiki Takeoka, Zhongying Zhang, Takashi Yurube, Kunihiko Miyazaki, Hiroki Ohnishi, Masao Ryu, Naotoshi Kumagai, Kohei Kuroshima, Yoshiaki Hiranaka, Ryosuke Kuroda, Kenichiro Kakutani
  • Organizer: 69th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ラット椎間板においてTransient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4)がオートファジーと細胞外マトリクス合成へ与える影響 (2023)
  • Author(s): 松尾智哉, 武岡由樹, 張鍾穎, 由留部崇, 宮崎邦彦, 大西洋輝, 劉正夫, 熊谷直利, 黒島康平, 平中良明, 黒田良祐, 角谷賢一朗
  • Organizer: 第52回日本脊椎脊髄病学会学術集会
• [Presentation] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 （TRPV4）活性化によるラット椎間板髄核細胞のオートファジーと細胞外基質合成の促進 (2023)
  • Author(s): 黒島康平，武岡由樹，張鍾穎，由留部崇，宮﨑邦彦，大西洋輝，劉正夫，松尾智哉，熊谷直利，平中良明，黒田良祐，角谷賢一朗
  • Organizer: 第52回日本脊椎脊髄病学会学術集会
• [Presentation] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) knockdown decreases extracellular matrix synthesis via autophagy suppression in rat intervertebral disc (2023)
  • Author(s): Tomoya Matsuo, Yoshiki Takeoka, Zhongying Zhang, Takashi Yurube, Yuji Kakiuchi, Yutaro Kanda, Ryu Tsujimoto, Kunihiko Miyazaki, Hiroki Ohnishi, Masao Ryu, Naotoshi Kumagai, Yoshiaki Hiranaka, Kohei Kuroshima, Ryosuke Kuroda, Kenichiro Kakutani
  • Organizer: SpineWeek 2023 (the International Society for the Study of the Lumbar Spine)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) activation promotes autophagy and increases extracellular matrix synthesis through AMPK pathway in rat intervertebral disc cells (2023)
  • Author(s): Kohei Kuroshima, YoshikiTakeoka, Zhongying Zhang, Takashi Yurube, Kunihiko Miyazaki, Hiroki Ohnishi, Masao Ryu, Tomoya Matsuo, Naotoshi Kumagai, Yoshiaki Hiranaka, Ryosuke Kuroda, Kenichiro Kakutani
  • Organizer: SpineWeek 2023 (the International Society for the Study of the Lumbar Spine)
  • Int'l Joint Research