Development of a Novel Treatment for Knee OA Using Adipose-Derived Stem Cells Focusing on Biological Interaction with Synovial Fluid

• Project/Area Number: 22K16779
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56020:Orthopedics-related
• Research Institution: Kanazawa Medical University
• Principal Investigator: 福 淳史 金沢医科大学, 医学部, 助教 (30932967)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: 脂肪由来幹細胞 / 滑液 / 変形性膝関節症

Outline of Research at the Start

近年膝OAの患者を対象とした脂肪由来幹細胞（ADSC）を用いた治療が行われており、疼痛・症状の改善に効果があると報告されている。膝OAの治療のために関節腔内に投与されたADSCは、関節腔内に貯留する滑液と接して様々な相互作用を受けると考えられる。しかし、関節腔内の滑液が、投与されたADSCに与える影響についてはほとんど報告されていない。本研究ではADSCに対する滑液の効果を細胞および分子レベルで解明することにより、ADSCが長期生存率の高い治療効果を保持することを目指した投与方法の開発を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

近年、変形性膝関節症(Knee OA)に対して培養した脂肪由来幹細胞(ADSC)による細胞治療が行われている。細胞は関節腔内に投与されるが、そこは関節腔内血漿の限外濾過液である滑液に満たされており、培養されたADSCは滑液と相互作用して治療効果を発揮することになる。しかし、滑液が投与されたADSCに与える影響はほとんど報告がない。そこで、本研究ではADSCに対する滑液の影響を遺伝子発現レベルで解析することで、より関節腔内で生存できるADSCの細胞製剤や投与方法の開発を目指す。臨床で行われているADSC細胞治療計画において、脂肪組織から単離されたADSCは細胞培養加工施設で拡大培養した後に、凍結保管されて投与場所に搬送される。凍結したADSCは関節内投与を行う直前に凍結融解され、生理食塩水等に懸濁されることで治療用のADSCとして関節腔内に投与される。既報の培養中でのADSCに対して滑液の曝露は細胞致死を示したが、本年度の成果として生理食塩水に懸濁された治療用ADSCは滑液に曝露されることで細胞生存率の維持が認められた。さらに、生細胞率の向上に寄与する細胞内因子を明らかにするために、DNAマイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析により、滑液添加によって発現が上昇する遺伝子群を同定できた。この遺伝子の一つであるFOSL1をノックダウンすると生細胞率が低下したことから、この遺伝子が関与することを証明できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、治療用に調製したADSCを関節腔を模した環境で培養し、膝関節症患者由来のSFを添加した場合の影響を検討した。SFの添加により、ADSCsの生存率の向上が観察された。DNAマイクロアレイを用いたSF処理したADSCの遺伝子発現プロファイリングにより、細胞の生存に関わるいくつかの遺伝子に変化が見られた。これらの遺伝子のうち、ADSCsの治療効果やがん幹細胞の生存・増殖に関与するFOSL1遺伝子に着目した。FOSL1のmRNAおよびタンパク質の発現が上昇していることを、それぞれRT-PCRおよびウェスタンブロット解析で確認した。次に、siRNAを用いてADSCsのFOSL1をノックダウンしたところ、細胞生存率の低下が確認され、ADSCsの生存にFOSL1が関与していることが示されました。興味深いことに、ノックダウンした細胞では、SF曝露によりADSCの生存率も低下していた。これらの結果は、SFがADSCsのFOSL1発現をアップレギュレートすることにより、細胞生存率を高めることを示唆していると考えられる。培養ADSCsを用いた治療において、ADSCsのFOSL1発現をよりアップレギュレートしやすい環境を構築できれば、ADSCsの治療効果がさらに高まる可能性があると考えられた。これらの成果をオープンアクセスの英語論文として発表することができた。

Strategy for Future Research Activity

治療用のADSCは投与され滑液に暴露されると生細胞率が維持されることから、より滑液中に生存できるADSCを開発することが変形性膝関節症に対する治療効果の向上に繋がることが期待される。したがって、治療用のADSCは各種培養条件(3D培養資材等)により滑液暴露後の長期生存率維持を目的とした研究を行う予定である。様々な会社で販売されている3D培養資材を用いての滑液中の治療用ADSCにおける生存率や遺伝子発現変動をマイクロアレイ、RT-PCRおよびサイトカイン産生量をELISAにより評価する。またKnee OAモデルマウスを確立したことからIn vivoでの評価にも繋げていきたい。

Research Products

• [Journal Article] Synovial Fluid Derived from Human Knee Osteoarthritis Increases the Viability of Human Adipose-Derived Stem Cells through Upregulation of FOSL1. (2023)
  • Author(s): Hironori Kitajima, Takuya Sakamoto, Tetsuhiro Horie, Atsushi Fuku, Yuka Nakamura, Hiroaki Hirata, Yoshiyuki Tachi, Naoki Yamamoto, Yasuo Iida, Yasuhito Ishigaki, Yusuke Shimizu, Toru Ichiseki, Ayumi Kaneuji, Satoshi Osawa, Norio Kawahara
  • Journal Title: Cells. Volume: 12(2) Issue: 2 Pages: 330-330
  • DOI: 10.3390/cells12020330
  • Peer Reviewed / Open Access