体外培養卵子誘導系/ChIL-seqを用いたヒト原始卵胞のFOXO1Aの機能解析

• Project/Area Number: 22K16880
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56040:Obstetrics and gynecology-related
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 濱田 律雄 九州大学, 環境発達医学研究センター, 特任助教 (70875822)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: 原始卵胞 / 体外培養 / 卵子 / FOXO1A / ChIL-seq / ChiL-seq

Outline of Research at the Start

原始卵胞は胎児期に形成された後に性成熟期まで休止した状態で維持され、初経後は月経周期毎にその一部が活性化され、数の減少に伴い閉経となる。この原始卵胞の活性化は不可逆的で、卵巣予備能の維持には原始卵胞の維持と活性化のバランスが重要である。そのバランスが崩壊すると早発卵巣不全に繋がり、不妊の原因となる。本研究により、ヒトにおける原始卵胞の形成および維持機構を解明することで不妊治療の新たな方法論の確立を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では「ヒトの原始卵胞形成および維持におけるhFOXO1Aの機能を明らかにすること」を目的とし、マウス体外培養系を用いて表現型を、ChIL-seqによって分子標的をそれぞれ解明する。
マウス原始卵胞では機能因子であるmFOXO3aが核内に局在し、活性化卵胞では核外に移行する。まず、hFOXO1AがmFOXO3aと同様の発現パターンを示すことをヒト卵巣組織切片で確認した。ヒト卵巣組織凍結切片の免疫組織化学染色および免疫蛍光染色で原始卵胞と活性化卵胞におけるhFOXO1Aの細胞内局在を確認し、また卵巣における原始卵胞の分布を確認した。卵巣組織内の原始卵胞を多く含む領域を含む断面で凍結切片を作製することでCｈIL-seqにより適した凍結切片を得ることが出来た。
以前にNobox、Figla、Tbpl2、Lhx8 の4 つの転写因子を強制発現させたES細胞から短時間で体外培養卵子誘導系を報告した。この系を用いて解析を行うために、PPT4を遺伝子導入したmFOXO3a KO mES細胞を樹立した。このmES細胞に導入するmFOXO3a⊿NES、hFOXO1A、hFOXO1A⊿NESのベクターを作製し、293T細胞にトランスフェクション後に免疫蛍光染色し、mFOXO3aおよびhFOXO1Aの核内・核外発現をコントロール出来ていることを確認した。。作製したmFoxo3a⊿NES、hFOXO1A、hFOXO1A⊿NESのそれぞれのベクターをNobox、Figla、Tbpl2、Lhx8 の4 つの転写因子を強制発現させたmFOXO3a KO mES細胞にトランスフェクションし、それぞれの強制発現細胞株を樹立した。樹立したそれぞれの強制発現細胞株を用いて、体外培養卵子誘導を行い、Phenotypeの解析を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究開始時の実験計画よりやや遅れている。昨年度に作製したmFoxo3a⊿NES、hFOXO1A、hFOXO1A⊿NESのそれぞれのベクターをNobox、Figla、Tbpl2、Lhx8 の4 つの転写因子を強制発現させたmFOXO3a KO mES細胞にトランスフェクションし、それぞれの強制発現細胞株を樹立した。樹立したmES細胞から体外培養卵子誘導系でPhenotype解析を行うことが出来ている。原始卵胞と活性化卵胞におけるhFOXO1Aの細胞内局在を確認し、原始卵胞を多く含む分布を同定したことで、CｈIL-seqにより適した凍結切片を作製することが出来た。しかし、その後に新たな検体が得られていないため、研究開始時の実験計画で予定していたChIL-seqを行えていない。

Strategy for Future Research Activity

手術で新たに得られたヒト卵巣組織の凍結切片において、hFOXO1Aのターゲット遺伝子同定のためにChIL-seqを行う。樹立した強制発現細胞株を用いて、PPT4を強制発現させた体外培養で卵子誘導を行い、原始卵胞形成におけるhFOXO1Aの機能解析を引き続き行う。