薬剤性難聴モデルの確立と新規治療薬の検討

Research Project

Project/Area Number	22K16901
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 56050:Otorhinolaryngology-related
Research Institution	Sapporo Medical University
Principal Investigator	角木拓也札幌医科大学, 医学部, 助教 (70706548)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000) Fiscal Year 2022: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Keywords	内耳有毛細胞 / 平面内細胞極性 / タイト結合 / 三細胞間タイト結合 / HDAC inhibitor / 繊毛形成 / Foxo3 / 薬剤性難聴
Outline of Research at the Start	内耳有毛細胞は自己再生能がなく、その障害は不可逆的であるが、聴力障害は生活において大きくQOLを低下させるため、内耳性難聴における再生医療が待ち望まれている。以前に我々は不死化内耳有毛前駆細胞を用いて、内耳性難聴への関与が示唆されているフォークヘッド型転写因子のFoxo3が細胞極性、繊毛形成に影響を与える結果を得た。今回我々はFoxo3の下流因子の解析を行うことで難聴の新規病態メカニズムを解明し、さらに薬剤性難聴モデルとして本細胞を用い、難聴の新規治療法開発への基礎研究を行う。
Outline of Annual Research Achievements	１）内耳細胞の再生を目的として、マウス内耳有毛前駆細胞（US/VOT-E36）における細胞遊走およびtight junction, epithelial cell polarity 蛋白の変化をみるために様々な増殖因子およびシグナル伝達阻害剤を処置した。結果、TGF-βR inhibitor　（EW）, EGFR inhibitor (AG), JNK inhibitor (SP), PYK2 inhibitor (PF43), PKCa inhibitor, HDAC inhibitor (JNJ)において細胞遊走能の明らかな抑制がみられた。3細胞間tight junction 蛋白Tricellulinにおいては、TGF-βR inhibitor (EW), EGFR inhibitor (AG), PKCa inhibitor, HDAC inhibitor (JNJ)において明らかな膜への発現誘導がみられた。Western blottingによるtricellulinを含めたtight junction proteinの発現変化については全ての阻害剤において明らかな変化はみられなかった。JNJ処置によりAcetylated tubulinの発現増加がみられた。２）難聴のメカニズム解析のために、難聴に関与が知られているHDACおよびautophagyの内耳細胞におけるapoptosisに焦点を当て、マウス内耳有毛前駆細胞（US/VOT-E36）を用いて検討した。HDAC inhibitor TSAおよびJNJ処置により明らかなapoptosisの誘導がみられた。mTOR inhibitorでありAutophagy 阻害剤でもあるRapamycin前処置によりHDAC inhibitorsのapoptosis誘導は阻害された。TricellulinはHDAC inhibitorsにおいて膜へ発現誘導がみられたが、Rapamycin前処置においては変化はみられなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 様々な増殖因子およびシグナル伝達阻害剤を処置した結果、細胞遊走能の抑制などの変化が確認された。またtricellular tight juntion蛋白のTricellulinの細胞膜への発現誘導なども観察され、各種増殖因子、シグナル伝達阻害剤処置による内耳有毛細胞での変化が観察された。このことは内耳細胞の再生についての今後の研究に寄与するものであり、一定の成果があげられた。また、難聴のメカニズムの解明においてもHDAC阻害剤処置によるアポトーシスの誘導が観察された上に、そのアポトーシス誘導を阻害する因子としてmTOR阻害剤の効果も確認することができた。このことは新規治療法解明に寄与する結果である。
Strategy for Future Research Activity	内耳細胞の再生を目的とした研究においては、３細胞間TJ蛋白としてはTricellulinのほかLSRなども知られており、Tricellulin以外の変化についても免疫染色やWestern blotting、RT-PCRなどで解析する。またそのほか増殖因子およびシグナル伝達阻害剤についても細胞遊走能や３細胞間TJ蛋白に影響の与える因子の有無についてさらなる検討を進める。また難聴のメカニズム解析を目的とした研究においては、mTOR inhibitorであるRapamycinによりHDAC阻害剤のapotosis誘導が阻害されたことに関連するそのほかの因子について、Western blottingやRT-PCRにより変化のある関連因子を解析する。