| Project/Area Number |
22K16923
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 56050:Otorhinolaryngology-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
鈴木 正宣 北海道大学, 大学病院, 講師 (70455658)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 好酸球性副鼻腔炎 / コラーゲン / 鼻ポリープ / Type2炎症 / 慢性副鼻腔炎 |
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| Outline of Research at the Start |
好酸球性副鼻腔炎の臨床上の最大の特徴である鼻ポリープでは、支持組織であるコラーゲンが減少していることが明らかになっている。しかし現在までに、Type2炎症がこの発現制御にどのように関連しているかは不明である。
そこで、本研究では、Type2炎症がコラーゲン発現に与える影響を検討するために、鼻粘膜由来の細胞でシグナル伝達やサイトカインなどを評価する。コラーゲン発現を制御する細胞内の亜鉛の変化をZinquin法による偏光顕微鏡検査で評価する。またTissue micro arrayで、Type2サイトカインの発現を評価し、亜鉛やコラーゲン発現との相関や臨床情報との関連を検討する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、難治性副鼻腔炎は増加傾向にある。中でも鼻ポリープを伴う副鼻腔炎 (CRSwNP、本邦の好酸球性副鼻腔炎の多くの症例が該当する）の割合が増えている。病態としてA. 鼻粘膜上皮のバリア機能の低下を背景としたTSLPやインターロイキン33等のサイトカイン産生亢進を契機に、B. Th2優位の免疫応答（Type2炎症）が生じ、その結果として、 C. リモデリングが生じフィブリン網形成やコラーゲンの低下による浮腫が遷延し、鼻茸が形成されると考えられている。この鼻ポリープでは支持組織の発現が減少していることが明らかになっている。しかし、Type2炎症がこの発現制御にどのように関連しているかの詳細は不明である。そこで、本研究では、上皮細胞から始まるType2炎症カスケードがコラーゲン発現に与える影響を検討し、その制御因子を同定することを目的としている。 これまでに鼻粘膜組織から採取した鼻粘膜上皮細胞や線維芽細胞などの培養を開始しており、特に上皮細胞は気液界面の培養も行っている。また、副鼻腔炎の各サブタイプを含むTissue Micro Array (TMA)の作製を開始した。このTMAを用いて各種サイトカインやフィブリン網、コラーゲンやその制御因子の発現を免疫染色法で均一な条件のもとに検討する。TMAは健常例（鼻中隔手術や頭蓋底手術）を含む全50例を予定している。また、Type2炎症とコラーゲンの関与の点で、免疫寛容に作用するHLA-Gタンパク質に注目した。HLA-Gタンパク質は同じType2炎症であるアトピー性皮膚炎の症状を緩和することが知られている。副鼻腔炎のフェノタイプごとにHLA-Gタンパク質の発現を評価している。また、同タンパク質の発現制御機序をin vitroで検討し、治療標的としての可能性を含め、現在、論文執筆中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
上述の通り、好酸球性副鼻腔炎をはじめとする、CRSwNP（Chronic rhinosinusitis with nasal polyps)の病態におけるType2炎症ーコラーゲン系を解明し、新規治療標的を見いだすために、本研究では、上皮細胞から始まるType2炎症カスケードがコラーゲン発現に与える影響を検討し、その制御因子を同定することを目的としている。そのためにはPrimary cellsの採取、培養などが重要となる。またin vivoでの解析も必要となるため多数のサンプル検体を要することが予想される。
実験系としては、すでに中心的な役割を占めるPrimary cellsの培養の最適化や、各薬剤の投与タイミングや至適投与量の検討などを行った。気液界面の培養（Air Liquid Interface (ALI) 培養）でのバリア機能を評価する実験系を確立した。これは粘膜の電気抵抗を測定することで、そのバリア機能を評価すると共に、バリア機能関連遺伝子の発現をqPCRやウェスタンブロット法で評価するという多軸評価である。また、臨床症例でのHLA-Gも評価することができている。
また、副鼻腔炎の各サブタイプを含むTissue Micro Array (TMA)を作製し、各種サイトカインやフィブリン網、コラーゲンやその制御因子の発現を免疫染色法で均一な条件のもとに検討する予定であるが、症例数は除外基準該当する例などを除くと検討に十分な例には到達しておらず、今後さらに多数の症例からのサンプルを実験系に回したいと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
鼻粘膜組織から採取した鼻粘膜上皮細胞や線維芽細胞を培養し、十分に増えた段階で、多種の薬剤を投与し、その影響を評価する。具体的には鼻粘膜上皮細胞には自然免疫リガンドの投与やS.aureusを感染させ、上皮由来のサイトカインやHLA-Gの発現を評価する。線維芽細胞にはアスコルビン酸とともにType2サイトカインやHLA-Gを投与し、コラーゲンを含めたタンパク質発現へのType2サイトカインの影響をqPCR法、免疫染色法、Westernbloting法、ELISA法で評価する。この際、濃度だけではなく時間も振ることで、濃度依存性の有無やタイムコースを取る。これにより、一点だけではなく複数点でのサイトカインやHLA-G発現を確認することができ、より包括的なタンパク質発現動態を評価することができる。
また、発現の変化が確認された場合、抗IL-4/IL-13抗体や抗IL-5抗体、抗TSLP抗体を含む各種薬剤との共培養も行う。これらは実臨床ですでに社会実装されている薬剤であり、こうした薬剤を使用している症例の鼻粘膜において、Type2炎症ーコラーゲン系がどのような挙動をみせるかを検討する。
また、副鼻腔炎の各サブタイプを含むTissue Micro Array (TMA)の作製も継続していき、HLA-Gや、各種サイトカインやフィブリン網、コラーゲンやその制御因子の発現を免疫染色法で均一な条件のもとに半定量化し、検討する。もし、何らかの差分をみいだすことができれば、IL-4,13,5などの発現量や他のType2炎症との相関関係も確認する。
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