| Project/Area Number |
22K16950
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 56060:Ophthalmology-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
高橋 静 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (00747925)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | 内皮細胞 / 網膜器官培養 / ライブイメージング / 血管新生 / 網膜 / 器官培養 |
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| Outline of Research at the Start |
網膜血管閉塞疾患では、虚血により網膜から硝子体に逸脱して伸長する病的新生血管が誘導される。一方、マウス網膜の虚血によって誘導される病的新生血管は自然に退縮し、虚血領域に再び血管が伸長していく。申請者はマウス網膜標本の観察から、「病的血管の内皮細胞は、網膜内に遊走して正常血管を再構築する機能を有するのではないか」という仮説に至った。これを実証するため疾患環境を考慮した実験システムを開発する。本研究は、マウス網膜器官培養法を新たに開発し、ライブイメージング解析系を構築 する。可視化した内皮細胞の動態を追跡し、病的新生血管を構成する内皮細胞が虚血領域の血管再構築に寄与することを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、マウス網膜の器官培養法を新たに開発し、発生期もしくは病的血管新生でみられる細胞動態をex vivoで評価するため観察系を構築する。これまでの予備実験から網膜本来の杯状構造を維持して培養すること、生体外で生体内と同等の血管新生を誘導させる環境を再現すること、の２つの課題の解決が必要であることがわかっている。
前年度は、網膜形態はtype1コラーゲンを硝子体腔に詰め、網膜全体をコラーゲン包埋することで形状保持を可能とした。本年度は前年度に引き続き、網膜血管の発生を再現できる培地ならびにサプリメントを検討した。生後4日の新生仔マウス網膜を培養内皮細胞に用いるEGM2に内皮細胞を増殖させるVEGFとFGF, 周皮細胞の増殖に必要なPDGFという増殖因子、血管のオルガノイド作成に用いられてるForskolinとTGFb受容体阻害剤を添加し40%酸素濃度下に24時間培養すると生後5日マウスの生体網膜の血管形態と同等の発生期血管新生をex vivoで誘導することができた。さらに、確立した仔マウス網膜の器官培養法を用いて、発生期の網膜血管新生の過程をex vivoでライブイメージングにも着手した。網膜血管をFITC-dextran、細胞核をHoechstで染色し共焦点蛍光顕微鏡で、網膜血管の先端のタイムラプス動画を撮影した。培養開始早期より急速に移動する細胞が観察できており、さらに長時間の観察を実施することで細胞個々の挙動を明らかにする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画どおり、新しく開発した網膜器官培養法を用いて発達中のマウス網膜血管新生のライブイメージングを取得できているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度はライブイメージングの精度を上げる。具体的には
1)内皮細胞の同定:Cre/loxPシステムを利用した組織特異的に細胞核を標識可能なレポーターマウス (R26R-H2B-EGFPマウス)を理研バイオリソースセンターから入手したのち、内皮細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するマウスと交配して内皮細胞核にGFPを発現するマウス網膜を作成する。または、量子ドット技術など生細胞核を染色し核を同定してイメージング後、網膜を固定して免疫蛍光染色することで後ろ向き追跡する。
2)二光子顕微鏡やライトシート顕微鏡でも同様の手法でタイムラプス動画を取得する。
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