Project/Area Number |
22K16990
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Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Basic Section 56070:Plastic and reconstructive surgery-related
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Research Institution | Kitasato University |
Principal Investigator |
杉本 佳香 北里大学, 医学部, 診療講師 (90775941)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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Keywords | エクソソーム / 骨組織由来間葉系細胞 / 唇顎口蓋裂 / 骨組織再生 / 長期凍結保存 |
Outline of Research at the Start |
当科では20年以上に渡り、骨再生の研究を行ってきた。細胞、足場、成長因子を組み合わせて組織再生を実現させる観点から、細胞は間葉系幹細胞と、足場は長年使用している培地等を用いて、成長因子としてgrowth factorを検討してきた。しかし、growth factorでは差異が生じず、その他の因子が関与している可能性が浮上し、エクソソームという細胞間伝達因子の存在に注目した。エクソソームとその内包する内容(microRNA,mRNA等の情報)に骨再生の鍵があるのではないかと考え、当科には20年来の長期凍結保存された検体を有しており、長期凍結が骨再生に影響するのか、も合わせて検討することとした。
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Outline of Annual Research Achievements |
エクソソームの効率的かつ短時間で、簡便な精製方法を確立すべく、新たに2種類の方法を施行し比較した。培養上清はコントロールとして誘導(-)群と、骨誘導群を作成し、day 0,4,7,9,14,18,21の計7回採取し、エクソソームを精製した。細胞や細胞残渣が含まれないように、培養上清を一度1500rpm(300g程度)にて5分程度遠心し上清を回収し、0.22μmフィルターを通してから使用した。 1つ目の方法はアミコンウルトラ15(メルク社)を用いて、スイングバケットローターを使用し4000gで約15-60分間回転させ、total量500μlとなるように調整した。培養上清20mlから500μl 1本精製された換算となり、これらのエクソソーム(Exo.)は、-80℃で保管した。2つ目の方法はDojindoのExolsolator Exosome Isolation Kitを用いて行った。こちらも最終total量は500μlとなるように調整した。こちらも同様に―80℃で保管した。エクソソーム採取最終日(分化誘導後21日)に、エクソソーム採取後に骨誘導なし群と骨誘導群のフラスコをAlizarin Redで染色し、骨分化誘導群で骨(カルシウム)が形成されていることを確認した。更に保存したエクソソームの一部を用いて、定量キットFluoroCet(Funakoshi)の蛍光法で概算量を確認した。今後はウエスタンブロッティングで定性確認予定であり、また以前他の3種の方法でエクソソームの精製比較をしているため、どの方法が良いかを確立し、in vivo の実験に移行予定である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
キットの購入が海外製のものが含まれていた為到着に予想外に遅れた。また精製方法のプロトコールと実際にやってみたところ、予想外に濃縮に手間取り、プロトコールの立て直しなどを余儀なくされたため。
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Strategy for Future Research Activity |
in vitroに関しては定量・定性実験を行い、どの方法が確実かつ簡便、高精製であるかを判定し、in vivoの実験に移行予定である。
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