真菌二次代謝産物Terreinが骨ホメオスタシスに及ぼす影響の免疫学的解析

• Project/Area Number: 22K17036
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 57030:Conservative dentistry-related
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 坂井田 京佑 岡山大学, 大学病院, 医員 (20907927)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2022: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: Terrein / 骨粗鬆症 / 免疫担当細胞 / 真菌二次代謝産物Terrein

Outline of Research at the Start

国内の骨粗鬆症患者数は約1,300万人に達し，適切な予防策を提供することが喫緊の課題である。骨破壊疾患の原因として破骨細胞の亢進が根本にある。現在，破骨細胞の活性を抑制することを意図し，抗RANKL抗体やBP製剤の適用が進められているが，既存薬は全身性に作用するため，抜歯時の顎骨壊死等の悪影響が懸念される。真菌二次代謝産物Terreinは破骨細胞分化を強力に抑制し，マウス骨粗鬆症モデルにおける大腿骨吸収を抑制するが，その機序は未だ不明な点が多い。そこで，マウス骨粗鬆症モデルといった骨疾患動物モデルを用いて，Terreinの薬理作用・機序を解明し，骨破壊疾患に対する新たな治療戦略の構築を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，骨粗鬆症マウスモデルを用いて，真菌二次代謝産物Terreinの免疫細胞に対する作用ならびにその機序を検証する。実験条件として，Terrein投与群，PBS投与群(negative control)，ゾレドロン酸投与群(positivecontrol)の3群に分けて標的免疫細胞に対するTerreinの薬理効果の検証を行った。
Terreinの標的となりうる免疫担当細胞に対する直接的な抗炎症効果を検証した。好中球に対する効果が強い場合，ヒト白血病細胞株HL-60細胞に1.25 % dimethyl-sulfoxideを添加して好中球様に分化させた後，Terrein投与後のスーパーオキサイド産生能や遊走能等に及ぼす影響を検証した。また，マウスから摘出した腹膜マクロファージを用いて，M1ま たはM2分化に影響を及ぼすかどうかをFlow cytometryを用いて解析した。さらに，FITC蛍光ビーズに対する貪食能の測定やTNF-a等の炎症性サイ トカインやRANTES等のケモカインの産生性をELISA法にて検討した。Th17細胞に対する効果が期待できる場合，通法に従い，マウスナイーブCD4 陽性T細胞を採取し，リコンビナントIL-6(10-30 ng/ml)およびTGF-b(1-5 ng/ml)の存在下で，CD3およびCD28を刺激して培養した。そして ，Terreinを投与した際のIL-17産生能等に及ぼす影響をFACSやELISA法等を用いて検証した。
また，先行研究の結果から，TerreinはCa2+のシグナル伝達経路を抑制する可能性(RANKL誘導性のPKCa/bIIのリン酸化抑制)が示唆される。そのため，上記のin vitroで用いる細胞における，Ca2+の細胞内取り込みを始めとしたCa2+シグナル伝達経路への影響をwestern blotting法で検討した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コロナウイルス蔓延に伴い，研究活動の遂行が思うようにいかなかった。また手技的に未熟な面もあり，研究データにばらつきが生じた。

Strategy for Future Research Activity

社会的な行動制限が概ね解除され，物流も回復傾向にある。当初の計画通り研究を実施する。