ドーパミンの下流のシグナル経路による象牙質形成機構の解明

• Project/Area Number: 22K17061
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 57030:Conservative dentistry-related
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 糸山 知宏 九州大学, 大学病院, 助教 (50884433)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000); Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: 象牙質 / 歯の老化

Outline of Research at the Start

高齢者の歯の変化として、第二・第三象牙質の添加による歯髄腔の狭窄が挙げられる。老年人口の増加から、根管が狭窄した治療困難な歯は、今後も増加していくと考えられ、歯髄腔狭窄のメカニズムの解明が求められる。これまでに申請者らは、ラットの象牙芽細胞層においてドーパミンおよびドーパミン受容体が発現し、さらにドーパミンが、前象牙芽細胞の象牙芽細胞関連因子の発現と石灰化物形成を促進することを報告している。そこで本研究では、象牙芽細胞においてドーパミンが象牙質を形成していると仮説を立て、その下流のシグナルとその制御機構を詳細に検討することで、第二・第三象牙質形成の制御機構のメカニズムの解析を目的としている。

Outline of Annual Research Achievements

歯の加齢変化の一つとして第二・第三象牙質の形成とそれに伴う歯髄腔の狭窄は報告されているが、そのメカニズムの解析は進んでいない。当研究室では、ラットの象牙芽細胞層においてドーパミンおよびドーパミン受容体が発現し、さらにドーパミンがPKAを介して前象牙芽細胞の前象牙芽細胞の象牙芽細胞関連因子の発現と石灰化物形成を促進することを報告した。これに加え、ドーパミンの下流であるPKAの標的基質がカルシニューリン脱リン酸化されること、さらにカルシニューリン阻害薬が第二象牙質形成を促進することに着目し、ドーパミンとその下流のPKAが象牙質形成を正の制御をしており、カルシニューリンが負の制御をしていると仮説を立てた。
前象牙芽細胞であるKN-3細胞に、Darpp-32免疫染色を行った。その結果KNー3細胞において発現が認めれられた。この結果からPKAとカルシニューリンの相互作用で下流の因子を調整している可能性が示唆された。
また、カルシニューリンの阻害剤であるFK506を用いて刺激した結果、アリザリンレッドS染色領域の増加を認めた。この結果からカルシニューリンが恒常的に象牙芽細胞の石灰化基質の形成を抑制していることが示唆された。またドーパミンの下流の因子であるPKAの阻害剤であるH89を用いて、KN-3細胞を培養した結果、アリザリンレッドS染色領域の低下がみられた。この結果からPKAは石灰化促進に関与していることが示唆された。またFK506およびH89を同時に添加し、KN-3細胞を培養した結果、アリザリンレッドS染色領域の増加を認めた。この結果からカルシニューリンがPKAより下流で石灰化を抑制している可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前象牙芽細胞であるKN-3細胞の培養系において、細胞がディッシュからはがれることがたびたびあった。FBSの量や培地交換のタイミングを場合分けする実験を行っていたため、当初の予定より進むことができなかったと考えられる。またラットの免疫組織化学染色も条件を確認している段階である。

Strategy for Future Research Activity

前象牙芽細胞であるKN-3の培養系は確立することができたので、今後解析を行っていく。また免疫組織化学染色も賦活化などの条件を見直している。KN-3細胞の刺激実験においても、他の活性薬や阻害薬を用いてドーパミンの下流シグナルの解析を行っていく。