環境負荷に応答した幹細胞が分泌する細胞外小胞による機能的血管網構築と歯周組織再生

• Project/Area Number: 22K17074
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 57040:Regenerative dentistry and dental engineering-related
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 坂口 晃平 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (70801455)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2025: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 低酸素 / 細胞外小胞 / エクソソーム / 歯周組織再生 / 間葉系幹細胞 / 細胞外膜小胞

Outline of Research at the Start

歯周組織再生の試みとして骨髄間葉系幹細胞が分泌する液性因子群に着目した。その中に含まれる細胞外小胞(MSCs-EV)が骨再生能を有し、低酸素条件下で培養回収した場合は高い血管新生能を有し骨再生能が増強することがわかってきた。低酸素条件で培養回収したMSCs-EVをラット歯周組織欠損モデルへ投与し歯周組織再生能を評価、低酸素条件が細胞に及ぼす影響を検証する。

Outline of Annual Research Achievements

ヒト骨髄間葉系幹細胞由来の細胞外小胞をラット歯周組織欠損モデルに投与したところ、新生骨形成および新生セメント質の形成がみられ、歯周組織再生能が確認された。ヒト骨髄間葉系幹細胞由来の細胞外小胞はラットの歯根膜細胞や骨髄由来間葉系幹細胞にとりこまれ、細胞増殖を促進する効果があることがあきらかとなった。
低酸素環境で細胞を培養することで種々の細胞が分泌する液性因子の組成が変化することがしられ、細胞生存などに有利に働くことが報告されている。ヒト骨髄間葉系幹細胞を種々な酸素条件で培養した。酸素濃度を1、5、10％（低酸素条件）、21%（通常酸素条件）で設定して培養を実施しそれぞれから培養上清を回収し、超遠心法により細胞外小胞を回収した。
1％酸素の低酸素条件で培養回収した細胞外小胞をナノトラッキングアッセイしたところ、直径が他群より大きく、Qubitアッセイにより細胞外小胞の回収量が他群と比較して増加した。ラット歯根膜細胞に同細胞外小胞を投与して培養したところ、WST assayにて１％酸素条件の細胞外小胞が最も細胞増殖を亢進した。ラット骨髄由来間葉系幹細胞においても同様であった。ヒト臍帯静脈内皮細胞に同細胞外小胞を投与して培養したところ、１％酸素条件の細胞外小胞が最も管腔形成を亢進（管腔総長および管腔分岐数が増加）した。また、１％、5％、10％の低酸素条件の細胞外小胞をラット歯根膜細胞に投与したところ、21％酸素条件とくらべてRunx2、Alpといった骨形成関連遺伝子の発現が通常条件と比べて上昇した。１%、5％、10％間で有意な差はみられなかった。ラット歯根膜細胞にPKHで標識した同細胞外小胞を投与し細胞内の取り込みを観察したが、酸素条件の違いによる有意な差はみられなかった。ラット骨髄間葉系幹細胞においても同様の結果であった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新型コロナウイルス感染症の感染拡大にともない、物品の納入が遅れたり、研究業務が中断となったりとやや遅滞が生じた。

Strategy for Future Research Activity

ヒト骨髄間葉系幹細胞由来細胞外小胞による歯周組織再生能があきらかとなり、in vitroで低酸素条件とくに１％酸素条件で培養回収した細胞外小胞は通常酸素条件と比べ、幹細胞の細胞の増殖および石灰化を亢進する作用を有していることがわかった。
今後は、種々の低酸素条件で回収した細胞外小胞をラット歯周組織欠損モデルに投与して歯周組織再生能を比較する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Immediate curative effects of exercise therapy in patients with myalgia of the masticatory muscles (2022)
  • Author(s): Sakaguchi K, Taguchi N, Kobayashi R, Taguchi K, Okada K, Kinoshita F, Hibi H
  • Journal Title: Journal of Oral Rehabilitation Volume: 49 Issue: 10 Pages: 937-943
  • DOI: 10.1111/joor.13355
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 骨髄間葉系幹細胞由来液性因子による骨格筋再生 (2024)
  • Author(s): 丸山紗季, 坂口晃平, 張, 日比英晴
  • Organizer: 第23回日本再生医療学会総会
• [Presentation] Quantitative evaluation of the masseter muscle stiffness in patients with temporomandibular disorders using strain elastography (2023)
  • Author(s): Kohei Sakaguchi, Minami Kato, Hiroshi Maruyama, Saki Maruyama, Kiyoshi Sakai, Hideharu Hibi
  • Organizer: The 25th International Conference on Oral and Maxillofacial Surgery
• [Presentation] メトトレキサート投与中に口腔を含む多臓器からの出血，敗血症性ショックを生じた一例 (2023)
  • Author(s): 鈴木秀祐, 坂口晃平, 小池恵利加, 藤尾正人, 日比英晴
  • Organizer: 第68回日本口腔外科学会
• [Presentation] 顎関節滑膜骨軟骨腫症の1例. (2023)
  • Author(s): 坪井亮仁, 藤尾正人, 坂口晃平, 佐世暁, 若杉将史, 日比英晴
  • Organizer: 第68回日本口腔外科学会
• [Presentation] COVID-19に罹患した口腔癌患者の放射線治療における感染対策 (2023)
  • Author(s): 坂口晃平, 岡部一登, 日比英晴
  • Organizer: 第32回日本有病者歯科医療学会
• [Presentation] 骨髄間葉系幹細胞が分泌する細胞外小胞による歯周組織再生 (2022)
  • Author(s): 坂口晃平，酒井陽，椙村有紀子，小間義朗，渡邊純奈，丸山紗季，丸山裕，日比英晴
  • Organizer: 第67回日本口腔外科学会総会・学術大会
• [Presentation] Exercise therapy in patients with degenerative disease of the temporomandibular joint (2022)
  • Author(s): Kohei Sakaguchi, Kiyoshi Sakai, Hiroshi Maruyama, Nanami Takano, Miku Imura, Nozomu Taguchi, Hideharu Hibi
  • Organizer: 100th General Session and exhibition of the IADR
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Near Infrared Phot-Antimicrobial Targeting Therapy for Periodontal Disease (2022)
  • Author(s): Hiroshi Maruyama, Kiyoshi Sakai, Kazuhide Sato, Kohei Sakaguchi, Yoshiro Koma, Junna Watanabe, Dong Jiao, Liu Kehong, Hideharu Hibi
  • Organizer: 100th General Session and exhibition of the IADR
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Porphyromonas gingivalis に対する近赤外線抗微生物ターゲット療法の開発 (2022)
  • Author(s): 丸山裕，酒井陽，小間義朗，渡邊純奈，坂口晃平，日比英晴
  • Organizer: 第67回日本口腔外科学会総会・学術大会
• [Presentation] 顎関節症患者に対するホームケアとしての自己牽引療法の有効性の検証 (2022)
  • Author(s): 髙野 菜名実、坂口 晃平、加藤 みなみ、丸山 裕、 井村 美孔、 酒井 陽、小林 里奈、田口 慧、田口 望、日比 英晴
  • Organizer: 第35回一般社団法人日本顎関節学会学術大会