多系統細胞に効率的に分化する歯髄幹細胞分画の純化とその抗炎症作用の解明

• Project/Area Number: 22K17080
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 57040:Regenerative dentistry and dental engineering-related
• Research Institution: The Nippon Dental University
• Principal Investigator: 原 基 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 助教 (90845281)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000); Fiscal Year 2023: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000); Fiscal Year 2022: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
• Keywords: 歯髄幹細胞 / 再生医療 / 歯の細胞バンク / 多系統分化 / 肝細胞 / 肝炎モデル / 細胞分化特異的転写因子 / 間葉系幹細胞

Outline of Research at the Start

間葉系幹細胞(Mesenchymal Stem Cell; MSC)は多くの細胞系統に分化し、有力な再生医療の細胞資源である。歯の歯髄細胞は自然脱落した乳歯や抜去智歯から得られるため、骨髄採取などに比較して費用や侵襲性が少なく、特に優れた細胞資源である。申請者が所属する日本歯科大学では歯の細胞バンク事業を行っている。申請者らはこれまで歯髄MSCが、肝細胞形質を有する細胞に分化し、動物モデルにおいて重症肝炎を改善する効果があることを明らかにした。歯髄細胞は将来性に富んだ細胞資源として、様々な疾患への応用が期待される。本研究では再生医療研究を発展させ、歯の細胞バンクの実際の臨床応用の確立を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

間葉系幹細胞(MesenchymalStemCell;MSC)は多くの細胞系統に分化し、有力な再生医療の細胞資源である。歯髄幹細胞とは、歯の歯髄組織に含まれる幹細胞のことである。幹細胞は、さまざまな細胞に分化できる細胞であり再生医療での重要な役割を果たしている。歯髄幹細胞は、自然脱落した乳歯や抜去智歯の歯髄から比較的簡単に単離できることや、神経や血管に分化しやすいことなどが特徴である。また骨髄採取などに比較して費用や侵襲性が少なく、特に優れた細胞資源と考えている。
特に申請者が所属する日本歯科大学では歯の細胞バンク事業を行っている。申請者らはこれまで歯髄MSCが、肝細胞形質を有する細胞に分化し、動物モデルにおいて重症肝炎を改善する効果があることを明らかにしてきた。本研究の目的は歯髄細胞から多彩な分化能を示すMSC細胞集団を効率的に抽出し、様々な細胞へと分化させる効率的かつ費用対効果に優れた精製＋分化アルゴリズムの確立を目指し、既に運用されているバンク事業の実用化に向けたステップとすることである。実際には倫理委員会での承認を得たうえで、ヒト歯髄間葉系幹細胞の細胞増殖曲線を明確にし、肝細胞様細胞に効率よく分化させる方法を検証している段階である。しかしながら歯髄MSCの増殖曲線による適当な増殖能と肝細胞様細胞への分化因子の至適な組み合わせを見出すことに苦慮しているのが現状である。今後はこの培養過程の安定したプロトコールを樹立したいと考えている。またFACSによる細胞表面マーカーの解析を勧め、多系統の細胞分化を担う幹細胞集団を効率的に同定する方法を開発したい。また、その過程でどのような転写因子が発現し、メチル化などのEpigeneticな変化が進行していくのかの基礎的なデータを蓄積していきたい。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

申請者は大学院時代の研究とスタートアップ研究支援に基づいた細胞培養や動物実験の研究経験によって、これらの技術には習熟している。しかしながら間葉系幹細胞（MSC）の培養、分化への至適培養条件の決定は予想以上に難しく今現在、試行錯誤を繰り返している。具体的にはMSCの肝細胞類似細胞分化に関しても、過去20を超える報告があるが一様ではなく、MSCには表面マーカーからみたHeterogeneityが存在しており、単にFriedstein法のように細胞増殖能の高い細胞集団が分化に適しているという単純な理由でもなさそうである。従ってMSCの増殖曲線による適当な増殖能と分化因子（例えば肝であればActivin、FGF、HGF、インスリン）の至適な組み合わせがどこに存在しているのかということを見出すことがなかなか難しいと実感している。また、申請者が実験を行う日本歯科大学新潟生命歯学部内科学講座では2023年に三眼蛍光顕微鏡装置が購入されるため、これまでの研究に供することができなかったことも一因と考えている。

Strategy for Future Research Activity

現在のMSCの培養、及び分化の基礎実験を進行させ、効率よく多系統へ分化する細胞集団を表面マーカーの解析から同定することを試みたい。過去の多くの報告によればCD73、CD105、更にCD117などがMSCの分化能発揮に必須であるとされる。これらの報告を参考にして、種々のCD分子特異抗体の組み合わせによって、増殖能、分化能に優れたMSC分画を精製する。そして精製したMSC分画の肝細胞への分化誘導を基礎的な方法として発展させ、培養上清に加える成長因子を変え骨、軟骨、歯、神経、脂肪、ラ氏島への多系統細胞分化能を検証する。（研究協力者の大越、石川の指導を受ける。）更に可能であれば、Cytokine/Chemokineを網羅的に解析し、歯髄MSC由来肝細胞を門脈内に移入した場合と骨髄MSCを移入した場合を比較検討して特異的にUp,down-regulateされるCytokine/Chemokineを同定したいと考えている。
また特定したCytokine/Chemokineに対する特異抗体でMSC培養上清からProteinG-Sepharoseによって当該蛋白を除去し、歯髄MSC由来肝細胞の移入との相乗効果を検証し、肝炎抑制の病態解明にアプローチする。