顎骨再生を目的とした顎骨骨髄由来間質細胞の骨形成能マーカーの探索とメカニズム分析

• Project/Area Number: 22K17095
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 57040:Regenerative dentistry and dental engineering-related
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 駒走 尚大 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 助教 (00878267)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: 顎骨骨髄由来間質細胞 / MBMSC / 骨再生 / 骨形成マーカー

Outline of Research at the Start

間葉系幹細胞（MSCs）は骨、軟骨、脂肪等への多分化能を有しており、MSCsを用いた再生医療が臨床応用されてきている。「顎骨」骨髄由来間質細胞（MBMSCs）は歯科領域における骨再生医療の有用な細胞供給源となりうる。しかし、採取したMBMSCsの骨形成能はロット間の差が大きく、治療効果が安定しないという問題があった。そこで、顎骨増生治療を成功させるため、移植前に細胞の持つポテンシャルを把握しておく必要がある。本研究では、MBMSCsが細胞外に分泌する骨形成能の指標となりえるタンパク質を同定し、同タンパク質がMBMSCsや周囲の組織に及ぼす影響とそのメカニズムを明らかにすることを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

骨増生治療を成功させるためには、移植前に細胞の持つポテンシャルを把握しておくことが求められるが、これまでは明確なエビデンスがないままに治療が行われている。また、間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cells：MSCs）による骨再生治療は長らく研究されてきたが、生体内での骨形成能を見極める絶対的な指標は見つかっていない。そこで、MSCsが初期培養時に細胞外へ分泌するタンパク質が、骨形成能の判定に使用できるのではないかと考え、顎骨骨髄由来間質細胞（Maxillary/Mandibular Bone Marrow Stromal Cells：MBMSCs）が細胞外に分泌する骨形成能の指標となりえるタンパク質を同定することを目指す。
これまでの研究活動よりMBMSCsの培養上清中のCHI3L1が培養早期におけるMBMSCsの骨形成能ネガティブマーカーとして活用できる可能性があることが分かり、そのメカニズムを解明しようとしたが、ヒトから採取したMBMSCsは有限であり、メカニズムを解明するには細胞数が足りない。
そこで、新たなMBMSCsを複数株用いて骨形成能予測マーカーの探索を行うこととした。まず、今回使用するMBMSCsのin vivoでの骨形成能を評価する必要があるため、MBMSCsを骨補填材と混和して移植体を作製し、免疫抑制マウスの頭部骨骨膜下に移植した。８週間後に移植部位を含む組織を回収し、HE染色を行い、骨の新生量を分析した。さらにタンパクアレイキットを用いて網羅的に分泌タンパクの分泌を行った。しかし、今年度行ったタンパクアレイでは骨形成能を予測できるような分泌タンパクは同定できなかった。
今後は別種類のタンパクアレイキットやELISA法を用いて高い骨形成能、または低い骨形成能を有するMBMSCsが分泌するそれぞれのタンパク質を同定する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

過去に実験で使用していた細胞は数が少なくなってきたため、新たなMBMSCsのin vitroでの骨分化能、in vivoでの骨形成能を分析する必要性があり、分析を行った。そして、骨形成能が高いMBMSCs、低いMBMSCsがそれぞれ多く分泌するタンパクを同定するために、タンパクアレイキットを用いて分泌タンパクの同定を行ったが、骨形成能を予測できるような因子は発見できなかった。
そのため、MBMSCsが細胞外に分泌する骨形成能の指標となりえるタンパク質を同定し、同タンパク質がMBMSCsや周辺の組織に及ぼす影響やそのメカニズムを明らかにするまでには至っていない。

Strategy for Future Research Activity

新たなMBMSCsの移植実験、切片製作を行い、移植による細胞の骨形成能を分析を行っている。タンパクアレイキットを用いて各分泌タンパクの解析したが、骨形成能を予測できるような因子は発見できなかった。
タンパクアレイキットは他にもいくつか種類があるので、今後はそれらを使用して骨形成能を予測できるような分泌タンパクを発見する。また、その発見した分泌タンパクについてELISA法を用いて高い骨形成能、または低い骨形成能を有するMBMSCsがそれぞれどの程度分泌しているかを分析する。