| Project/Area Number |
22K18235
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Review Section |
Basic Section 90140:Medical technology assessment-related
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
|---|
Principal Investigator |
山下 拓真 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子医薬部, 研究員 (10866528)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
|
|---|
| Keywords | PCR / ゲノム編集 / オフターゲット変異 / 変異 / シークエンス解析 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
現在、幅広い遺伝性疾患を根治可能な遺伝子治療として、ゲノム編集技術の治療応用が期待されている。しかしながら、目的外の部位での変異（オフターゲット変異）によるがん化等のリスクが問題となっている。現在、細胞でのオフターゲット変異の検出は主として細胞のゲノムDNAの解析によって行われているが、この検出感度は低く、安全性確保のために十分とは言えない。
そこで本研究では、オフターゲット変異を簡便かつ高感度に検出する方法を確立することを目的として研究を行う。このために、修飾オリゴDNAを用いて変異を有する配列を優先的に増幅したのちに次世代シークエンシングを行うClAmp-seq法を新たに構築する。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
近年、CRISPR-Cas9などのゲノム編集技術によってゲノムDNAの配列を自由に変更することで、あらゆる遺伝性疾患の治療が可能になることが期待されている。しかしながら、標的配列と類似した配列を持つ部位で変異が起こるオフターゲット変異によるがん化等の有害事象が懸念されており、オフターゲット変異の予測・評価がゲノム編集を用いた遺伝子治療の安全性確保のために重要である。オフターゲット変異の評価は一般的に、標的配列と相同性の高いオフターゲット変異候補部位について、実際に細胞に作用させた際にそれらの部位に変異が起こっているかどうかを、当該部位を増幅して次世代シークエンシングを行う方法 (Amplicon-seq) により検出することで行われている。しかしながら、この方法による変異の検出感度は0.1%程度であり、より高感度な変異検出法の開発が望まれている。そこで本研究では、変異のない配列の増幅を選択的に阻害する修飾オリゴDNA（クランプDNA）を用いてAmplicon-seqを行う高感度検出法ClAmp-seq法を確立する。
昨年度の検討において、複数のクランプDNAを設計して、増幅抑制効果の違いを定量的PCR法により検討した結果、修飾核酸の導入位置による予想外の効果の違いが見られた。したがって本年度は、実際の変異DNAを用いた検討に先立ち、このことを複数のモデル配列を用いて検討した。その結果、複数のモデル配列間でクランプDNAによる増幅抑制効果には差が見られたものの、クランプ核酸中の修飾核酸の導入位置による増幅抑制効果への影響については同様の傾向が見られ、当初観察された修飾核酸の位置による増幅抑制効果への影響が塩基配列に依存するものではないことが示された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究においては、最適なクランプDNAの設計法について検討したのち、これを用いた変異の検出感度について検討を行う予定である。
本年度においては、クランプDNAの設計に関する検討を実施する過程で、修飾核酸の導入位置による予想外の効果の違いが見られたことから、実際の変異DNAを用いた検討に先立ち、このことを複数の配列を用いて検討することとしたため、計画との違いが生じた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定通り、ゲノム編集細胞から抽出したゲノムDNAに対して、クランプDNAを設計する。これを用いて、定量的リアルタイムPCR及びシークエンス解析によって、変異の検出感度について評価する。
|
