| Project/Area Number |
22K18298
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 22:Civil engineering and related fields
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
赤松 良久 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (30448584)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中尾 遼平 山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授(特命) (10814618)
愛知 正温 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 講師 (40645917)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥25,480,000 (Direct Cost: ¥19,600,000、Indirect Cost: ¥5,880,000)
Fiscal Year 2024: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000)
Fiscal Year 2023: ¥8,320,000 (Direct Cost: ¥6,400,000、Indirect Cost: ¥1,920,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,190,000 (Direct Cost: ¥6,300,000、Indirect Cost: ¥1,890,000)
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| Keywords | トレーサー / 人工DNA / 地下水 / 土砂還元 / 環境DNA / 海綿 / リポソーム / 流域水・土砂動態 / 地下浸透流 |
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| Outline of Research at the Start |
既存の流域における水・物質の動態に関わる研究では，自然界に存在する栄養塩や同位体をトレーサーとして用いるため，顕著な濃度変化が必要であり，局所的な水・物質の動態の把握は困難であった．そこで，本研究では自然界に存在しない人工DNAトレーサーを開発し，トレーサーを用いた地下水動態や土砂動態の把握を実現する．具体的にはリポソームでプラスミドDNAを包み込み，マイナスに帯電した土砂透過型とプラスに帯電した土砂吸着型の2種類のトレーサーを開発する．前者を用いた地下浸透流の動態把握および後者を用いた河川における土砂動態の把握について，室内実験および現地実証実験により有効性を明らかにする．
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）DNAトレーサー開発： DNAデータベースに登録されているミトコンドリアDNAの塩基配列をもとに，分類群の異なるDNAを組み合わせることで，自然界には存在しない4種類のトレーサーDNAを開発した．また，トレーサーDNAを検出するためのリアルタイム定量PCRの検出系（プライマーおよびプローブ）を開発し，実際にこれらのDNAを検出可能であることを確認した．従来，DNAを封入するリポソームは医療・美容分野で用いられる素材であるため，本研究では野外環境へ投入可能な環境負荷のない脂質素材の探索・検討を行った．その結果，3種類の素材が利用可能であることが示された．しかし，リポソーム封入DNAを大量に作成する際のコストの関係から，そのうちの1種類が最も効率的であると考えられた．
２）レシーバー開発：海綿の吸着・回収能を他の素材4種(台所スポンジ，こんにゃくスポンジ2種（以降，竹炭入り，竹炭なし），脱脂綿)と比較・評価するため，模擬下水路でのDNAトレーサーの添加・回収実験を行った．素材の2回の圧搾により回収されたDNAトレーサー量は，海綿（回収率：0.26％）＞竹炭入り（0.065％）＞台所スポンジ（0.061％）＞竹炭なし（0.013％）＞脱脂綿（0.0016%）の順で多かった．また，海綿では10回目の圧搾液からもDNAトレーサーが回収され，回収量が圧搾2回目以降緩やかに減少していくことが確認された．以上より，海綿は吸着・回収力に優れ，水環境中の有機体の吸着・回収に有効であることが示唆された．一方，圧搾では海綿から十分にDNAトレーサーが回収されないため，タンパク質分解酵素を用いた海綿からの直接核酸抽出による回収を行ったところ，回収率の向上が確認された（23.4%）．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
人工DNAトレーサーの開発においては野外環境へ投入可能な環境負荷のないDNAを封入する脂質素材の探索・検討に想定以上に試行錯誤が必要であった．そのため，土砂透過型と土砂吸着型の2種類のトレーサーの開発には至らなかった．しかし，従来のリポソームを用いた4種類の人工DNAトレーサーを作成した．また，レシーバーとしては海綿が有用であることを，既存のリポソーム型トレーサーを用いて明らかにすることができた．
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| Strategy for Future Research Activity |
R5年度には土砂透過型と土砂吸着型の2種類のトレーサーの開発を進める．また，人工DNAトレーサーによる地下水動態の把握のために，実験水槽を用いて様々な粒径の土壌（粘土，砂，礫等）を対象としてリポソーム型DNAトレーサーの有効性を検証する．さらに，野外の実験用の注入孔にDNAトレーサーをパルス状に投入し，流れの下流の回収孔で採取した水のDNAトレーサーの濃度を連続的に計測することにより，トレーサーの到達時間から地下水流速を明らかにする．この実験では同時に既存のトレーサー（塩分，染料等）を用いた同様な実験と比較することによって，DNAトレーサーの有効性を検証する．
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