Project/Area Number |
22K18359
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Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
加藤 貴之 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20423155)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松本 篤幸 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (00753906)
宮ノ入 洋平 大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (80547521)
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Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥25,870,000 (Direct Cost: ¥19,900,000、Indirect Cost: ¥5,970,000)
Fiscal Year 2024: ¥10,920,000 (Direct Cost: ¥8,400,000、Indirect Cost: ¥2,520,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,450,000 (Direct Cost: ¥6,500,000、Indirect Cost: ¥1,950,000)
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Keywords | クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / NMR / ハイブリッド構造解析 / 融合構造解析 / 電子顕微鏡 |
Outline of Research at the Start |
クライオ電子顕微鏡による全体構造から徐々に高分解能な情報を得ることができる。一方NMRは原子間情報を基にその立体構造を解析する。つまり両者の構造解析の方向性は真逆になっている。両者が優位に得られる情報を互いに補完し融合できれば、大きな分子の溶液中での構造を完全な形で解析することができる。そのため、本研究ではクライオ電子顕微鏡によって主鎖構造を、NMRによって原子間距離情報を得て、それを融合し高分解能構造解析が可能な手法を開発する。
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Outline of Annual Research Achievements |
近年クライオ電子顕微鏡による構造解析の分解能は飛躍的に改善し、構造生物学において欠かすことのできない手法に成長した。特に大きな複合体や柔軟な構造を持つような分子には第一選択的に用いられ、創薬にも用いられるようになった。しかし、部分分解能に関しては必ずしも高くなく、溶媒に面している領域では側鎖まで可視化できることはそれほど多くない。 一方NMRは構造解析の手法としては溶液中の運動性を評価で利点を持っているが、大きな分子には構造解析できないことや同位体ラベルする必要性があることなど欠点を持つ。 しかしこの2つの技術は互いに補うことが可能であり、クライオ電子顕微鏡で主鎖構造を、NMRで側鎖の相対的な位置を解析できれば、運動性を含んだ高分解能な構造解析が可能である。 そこで、まずNMRで同位体ラベルをせずにHのみのシグナルから原子間の距離情報を取得する方法を模索することにした。同位体ラベルなしの場合、クライオ電子顕微鏡での観察試料をそのままNMR測定に持ち込むことができるため、利便性が高く汎用性を求めるためには必須である。今回標準サンプルとしてすでに構造が解析されているTET2を用いて実験を行った。TET2は分子量約450 kDaの複合体であり、そこからのHのシグナルは非常に多く2次元に展開してなお、互いに重なり合い帰属に使うことはできず、距離情報を得ることは困難であった。しかし、フェニルアラニンやトリプトファンなど芳香族アミノ酸に由来するHのシグナルは他のアミノ酸由来のHのシグナルとは異なる化学シフトを持つため、その由来を知る可能性があることがわかった。また、重なり合ったシグナルも、既知構造から各原子由来のシグナルの位置を予測するプログラムを使うことで帰属が可能となる可能性を見出した。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
クライオ電子顕微鏡による構造解析は現在ルーチン化しており、試料さえ安定に精製できれば構造解析は比較的容易である。特に主鎖構造に関しては原子分解能を要求されないため、かなりハードルは低い。 その一方で、NMRはそれ単体で構造解析するにはさまざまな工夫と労力が必要となる。そのため特にNMRでは可能な限り簡便に、必要な情報だけを効率よく取り出す工夫が必要となる。現在はその工夫の必要性が出てくる問題点の洗い出しを行っており、おおよその問題点については明確になったと認識している。それらの問題点に対してどのようなアプローチをしていくのかが最もいいのかを検討していく予定である。
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Strategy for Future Research Activity |
この研究では特にNMRの情報をいかにうまく使うかが1番の鍵となる。すでにクライオ電子顕微鏡によって構造解析された主鎖構造を制約条件にすることで、側鎖の情報だけをNMRで取得することで十分に高分解能な解析が可能となる。現在主鎖構造を拘束し、分子動力学シミュレーションを行うことで、各側鎖のプロトン間の距離情報がどれくらいNMRによる測定結果を反映するかを検討していく。また必要に応じてalphafoldやフレキシブルフィッティング等を利用し、現在のNMRの情報から必要な距離情報を効率的に取得する手法を見出す。本年は特にNMR測定におけるミキシングタイムを変えて測定を行い、より近いHの距離情報から側鎖の方向と位置を決定してく。
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