| Project/Area Number |
22K18363
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | Osaka University (2023)
Institute of Physical and Chemical Research (2022) |
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Principal Investigator |
廣島 通夫 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 特任准教授(常勤) (20392087)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000)
Fiscal Year 2024: ¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000)
Fiscal Year 2023: ¥13,130,000 (Direct Cost: ¥10,100,000、Indirect Cost: ¥3,030,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
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| Keywords | 細胞状態の多様性 / 大規模1分子計測 / 細胞の多様性 |
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| Outline of Research at the Start |
蛍光1分子イメージングの大規模計測が実現したことから、分子現象の時空間ダイナミクスに関する広範な情報が読み取れるようになった。細胞で生じる分子イベントの平均的描像だけでなく、その多様性についても知見が得られる。そこで本研究では、シグナル伝達に関わる動的な分子状態に着目し、今までと異なる観点から細胞の多様性のメカニズムを探ることを目的とする。細胞現象を司る新しい分子メカニズムを明らかにすることで、大規模1分子計測から細胞の特性や応答の予測が可能となる。さらに得られた結果を基に、従来法より情報が多く分子状態の多様性を考慮した新規薬剤スクリーニング法として、薬理学分野での展開に挑む。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では細胞応答の多様性の起源を明らかにするため、シグナル伝達経路で機能している分子個々の状態とその分布を解析することで明らかにする。さらに、分子の状態解析から細胞の応答を予測する新しい研究領域の開拓につなげる。この従来にないアプローチを実現するため、蛍光1分子イメージングの大規模計測から広範な情報を読み取る手法を確立する。また、同一細胞で1分子レベルでの動態計測とオミックス解析が可能な系を開発し、分子状態に現れる多様性と発現遺伝子との関連を見いだす。一方、現在実証中の1分子動態に基づく新規薬剤スクリーニングに、上記の解析を基に決定した分子の多様性を評価する指標を取り入れ、細胞の多様性も考慮した治療薬が選択される手法に発展させる。また、治療薬の効果に影響を与える細胞老化に着目し、分子状態の多様性がどのように変化しているか、老化を誘導した細胞などを用いて明らかにする。
2023年度は、全自動細胞内1分子イメージングシステム（AiSIS）に1細胞ピックアップシステムの組み込みを行った。実際に1分子計測後の細胞ピックアップが可能か、購入前に数度のデモを通じて細胞種や溶液条件を検討した。並行して、1分子計測からピックアップまで一連の過程を全て自動化するために、機器間の通信方法や操作プロトコルの検討を各担当メーカーと行った。また、細胞を人為的に老化させる手法にセルソーターを導入し、確実に変化した細胞が得られるよう最適化を進めた。導入後は実際に観察した細胞のピックアップに臨み、上皮成長因子受容体（EGFR）の1分子動態やERKの核移行を観測後、同じ細胞をピックアップすることに成功した。今後は自動化の実施と大規模計測への応用を図る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、細胞内分子の1分子計測を網羅的に行うと同時に、同じ細胞をピックアップして遺伝子解析を行い、分子動態を決定している因子の解明を目指す。2023年度は、1細胞ピックアップシステムとしてニコン社製の空気ペンの導入を行った。購入前には実際に1分子計測条件下での細胞ピックアップが可能か、顕微鏡条件、細胞腫、溶液条件などそれぞれについて検討を繰り返し、問題のないことを確認した。一方、大規模計測に備えて1分子計測から1細胞ピックアップに至る過程を全て自動化するため、（株）ニコン、（株）ZIDOの担当者と機器間の通信方法や計測プロトコルについて検討を行い、その方法を決定した。導入後は実際に個々の細胞でEGFRの1分子動態あるいはERKの細胞核移行を観測し、直後に各々の細胞をピックアップすることに成功した。現在は各機器を手動で扱い具体的な操作についての検証を行っているが、今後はこれら一連の操作を自動化のプロトコルに組み込んでいく。またデータ解析については、昨年度に隠れマルコフモデル（HMM）と機械学習により分子状態を推定するプログラムの改変を行い、運動状態に加え多量体サイズの推定にまで可能となった。EGFRの分子動態に反映される分子構造と細胞膜環境の情報や、多量体形成に反映される下流のシグナル伝達効率に関する情報が取得できる。以前の解析手法と比較し、状態と実際の現象との対応が明確になりデータサイズも縮小できる利点があるが、それでも状態数は12に及ぶため、クラスタリングなどの手法によってさらに状態を分類する必要があり現在検討中である。
また本研究で注目する細胞老化についてはDoxorubicinにより人為的に誘導する手法を用いている。この際、細胞増殖などに生じる変化をCO2インキュベーター内で長時間、蛍光顕微鏡での観察を可能とするため、Cellogerを導入した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度は導入した1細胞ピックアップ装置操作の自動化および関連するプログラムの開発を、ピックアップ装置のメーカーおよびAiSISの制御プログラムを作成している企業と共同で進める。また、ピックアップした細胞で今後定量解析の対象となる遺伝子発現について、RNAシークエンシング（RNA-seq）による解析を目指し、手法および解析対象について検討を進め実際の計測までを行う。この際、1細胞の解析に先立ち、細胞群から得られる細胞状態と遺伝子解析それぞれの平均について比較を行うことで、分子の状態や機能と遺伝子発現レベルの間に介在しているメカニズムの解明を試みる。一方、分子状態から細胞状態を同定する手法についてクラスタリングなどを用いてブラッシュアップし、1細胞解析への応用を図る。
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