哺乳類の多細胞組織や器官をex vivoで生きたまま解析可能な透明化法の開発

• Project/Area Number: 22K18373
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 46:Neuroscience and related fields
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 稲垣 成矩 九州大学, 医学研究院, 助教 (30827952)
• Project Period (FY): 2022-06-30 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000); Fiscal Year 2024: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2022: ¥21,710,000 (Direct Cost: ¥16,700,000、Indirect Cost: ¥5,010,000)
• Keywords: 組織透明化法 / 蛍光イメージング / 大規模計測

Outline of Research at the Start

哺乳類のような複雑な生命システムを理解するためには、まずは組織・器官、そしてゆくゆくは個体全体を、単一細胞レベルの分解能で解析する必要がある。近年、組織透明化法が普及したことで、PFA固定した組織・器官においては、蛍光イメージングによる大規模な解析が可能になっている。しかし、固定標本を対象とした従来の手法では、動的な生命現象を理解することはできない。そこで本課題では、組織・器官を、生体外で“生きたまま”解析できる組織透明化法の開発を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

昨年度の実験により、生きた細胞を非侵襲的に透明化（ライブ透明化）可能な試薬Xの同定に成功した。当該年度では、この試薬Xを用いた応用実験を行った。
1. 試薬Xを溶解した培地の調整：試薬Xによるライブ透明化に最適な屈折率を決定した。また試薬Xを溶解した培地を等張にするために必要な元の培地の希釈率を決定した。また細胞の機能に干渉しないためのイオン組成を決定した。この試薬Xによる調整培地をSeeDB-Liveと命名した。
2. ex vivo組織における深部イメージング：SeeDB-Liveで透明化した培養細胞スフェロイドと急性脳スライスにおいて、蛍光イメージングを行ったところ、イメージング深度が二倍ほど向上することが分かった。また急性脳スライスにおいて、神経細胞の自発発火をカルシウムイメージングにより計測したところ、透明化前後で自発発火の振幅と振動数に違いは見られなかった。このことから、SeeDB-Liveは生きたex vivo組織を非侵襲的に透明化できることが分かった。
3. 動物個体における深部イメージング：麻酔下マウスの脳に蛍光標識したSeeDB-Liveを浸透させた後、凍結切片を作製し、SeeDB-Liveの浸透度を評価した。その結果、脳表から800 umにわたり、濃度勾配がありながらもSeeDB-Liveが浸透していることが確認できた。そこで次に、麻酔下マウスの脳にSeeDB-Liveを浸透させ、第五層錐体細胞の蛍光を観察した。その結果、第五層錐体細胞の樹状突起や、脳表から700-800 umに位置する細胞体を高いSNで観察することができた。このことから、SeeDB-Liveは生きた動物個体の組織を透明化できることが分かった。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

ライブ透明化の利点を、様々な種類の標本で示すことができたため。

Strategy for Future Research Activity

今後は、ライブ透明化により、組織深部で膜電位イメージングが可能になるか検討する。またオルガノイドにおける深部観察が可能になるか検討する。

Research Products

• [Journal Article] Automated neuronal reconstruction with super-multicolour fluorescence imaging (2022)
  • Author(s): Leiwe Marcus N.、Fujimoto Satoshi、Baba Toshikazu、Moriyasu Daichi、Saha Biswanath、Sakaguchi Richi、Inagaki Shigenori、Imai Takeshi
  • Journal Title: bioRxiv Volume: - Pages: 512984-512984
  • DOI: 10.1101/2022.10.20.512984
  • Open Access
• [Presentation] ライブイメージングのための透明化試薬の開発 (2024)
  • Author(s): 稲垣成矩
  • Organizer: 第 6 回これからの神経回路研究の会
• [Presentation] 哺乳類の多細胞組織や器官を対象にしたex vivoライブ透明化法の開発 (2023)
  • Author(s): 稲垣成矩、今井猛
  • Organizer: 多細胞CREST若手の会2023
• [Presentation] 哺乳類の多細胞組織や器官をex vivoで生きたまま解析可能な透明化法の開発 (2023)
  • Author(s): 稲垣成矩、今井猛
  • Organizer: CREST多細胞、領域班会議
• [Patent(Industrial Property Rights)] 生体材料の透明化試薬 (2024)
  • Inventor(s): 今井 猛、稲垣 成矩
  • Industrial Property Rights Holder: 今井 猛、稲垣 成矩
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2024