| Project/Area Number |
22K18385
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 51:Brain sciences and related fields
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
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Principal Investigator |
徳永 文稔 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 教授 (00212069)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
及川 大輔 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20455330)
清水 康平 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 助教 (70727073)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000)
Fiscal Year 2025: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000)
Fiscal Year 2022: ¥7,150,000 (Direct Cost: ¥5,500,000、Indirect Cost: ¥1,650,000)
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| Keywords | タンパク質 / ユビキチン / 酵素 / 神経変性疾患 / 筋萎縮性側索硬化症 / 疾患修飾薬 / 細胞質封入体 / 炎症 / 化合物探索 |
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| Outline of Research at the Start |
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は運動ニューロンが変性することで筋力低下を引き起こす神経変性疾患で、現在のところ有効な治療法はないため、ALS発症に至る細胞機構の基礎解明を基盤とした創薬シーズ探索への挑戦は急務である。我々は、ALS患者神経細胞内封入体に多様な連結からなる複合型ユビキチン鎖が含まれていることを見出しており、これがALS発症の細胞機構に関わる可能性を着想している。そこで本研究では複合型ユビキチン鎖を生成するユビキチンリガーゼ(E3)を同定するとともに、E3を標的とした抑制剤を探索し、細胞やALSモデルマウスを用いて薬効を解析する。これによってALS発症機構の基礎医学的解明に貢献する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
筋萎縮性側索硬化症（ALS）は上位・下位運動ニューロンが選択的かつ進行的に変性・消失する神経難病であり、ほとんどの場合、TAR DNA-binding Protein of 43kDa（TDP-43）が細胞内にユビキチン陽性封入体を形成することで、神経細胞を変性・脱落させ、運動機能障害を引き起こす。ALSのみならず、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病など各種神経変性疾患では、疾患特異的なタンパク質がユビキチン陽性封入体を形成し、タンパク質毒性（プロテイノパチー）を発現することが病態進行の主因となっている。我々は、OPTN関連家族性ALS、孤発性ALS、およびADの細胞質封入体にM1鎖、K48鎖、K63鎖を含有する多様なユビキチン鎖が局在することを突き止めた(Neurosci Lett., 2019, J Neuropathol Exp Neurol., 2020)。また、M1鎖を生成する唯一のユビキチンリガーゼであるLUBACに対する阻害剤(HOIPIN-1)を独創的に開発し、HOIPIN-1をシードとしてより選択的で強力な誘導体(HOIPIN-8)を作出した(SALS Discov. 2018, BBRC 2019, Commun. Biol., 2020)。さらに、HOIPIN-8処理はNeuro2a細胞にてM1鎖生成を抑制することでALSに特徴的なTDP-43の凝集体形成を抑制することを明らかにした(Cells, 2022)。そこで本研究では、ALSモデルマウス（TDP-43A315T-Tgマウス）を用いてin vivoでのHOIPIN-8薬効解析を目指している。これまでのところ、HOIPIN-8投与（20 μg経鼻投与）によって雌Tgマウスにおいて運動機能が有意に改善し、大脳運動野や脊髄におけるユビキチン陽性封入体形成が減弱することを見出している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、LUBAC阻害剤(HOIPIN-8)のALSモデルマウスのin vivoにおける薬効を明らかにする目的で、ヒトTDP-43のAla315→Thr(A315T)変異体を発現するTgマウス(B6.Cg-Tg(Prnp-TARDBP*A315T)95Balo/J)を用いてHOIPIN-8を生後8週以降に20 μg/day経鼻投与することで生存と運動機能に対する影響を解析した。A315T-Tgマウスはユビキチン陽性封入体を形成した後、ALS様運動障害を呈し、死に至る。病態進行に雌雄差があり、雄の進行が早い。これまでの研究の結果、HOIPIN-8投与によって雄雌ともに生存に有意差は認められなかったが、進行の遅い雌マウスでは一時的に後肢握力やinverted screen testなどの運動機能が改善した。また、HOIPIN-8はTgマウスの大脳運動野(MC)や脊髄(SC)においてM1鎖のみならず、K48鎖やK63鎖を含むユビキチン陽性封入体形成を減弱させた。さらに、封入体中のリン酸化TDP-43、および神経炎症に関わるIba1陽性ミクログリアやGFAP陽性アストログリア、筋萎縮を抑制した。また、HOIPIN-8を投与することで、MCにおけるNeuN陽性神経細胞やSCにおけるChAT陽性神経細胞の減少を阻止した。この結果から、HOIPIN-8はLUBAC活性阻害を介して各種ユビキチン鎖陽性封入体形成を抑制し、ALSモデルマウスの一部運動機能低下を緩和させる可能性が示された。HOIPIN-8投与によって、M1鎖のみならず、K48鎖やK63鎖も減少したことから、これらのユビキチン鎖は協調的に生成される複雑型ユビキチン鎖である可能性があり、ユビキチンを標的にすることでタンパク質凝集、炎症、細胞死へ多面的な影響を与え、ALSの修飾薬シーズになる可能性を示唆している。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、①進行の早い雄A315T-Tgマウスには投与量を増加（40または60 μg/day経鼻投与）させ、容量依存的な病態修飾効果と毒性を確認する。高容量を用いることで改善効果が見られる場合は、雌マウスでも確認する。また、②我々はA315T-TgマウスのMC/SCにおいて少なくともM1鎖、K48鎖、K63鎖を含む封入体形成を検出しているが、このようなユビキチン鎖がいつ頃から生成されるのか、雌雄差を含めて基礎的な解析を行う。これを基にHOIPIN-8の投与開始時期を再検討する。③ユビキチン連結には他にもK6、K11、K27、K29、K33鎖の可能性があるが、神経変性疾患におけるこれらのユビキチン鎖の付加は不明である。そこで、脱ユビキチン化酵素の基質特異性を用いたユビキチン連結判別法(UbiCREST)にてA315T-TgマウスMC/SC由来凝集体画分のユビキチン連結を生化学的に明らかにする。さらに、同画分をトリプシン分解し、εKGG抗体で免疫沈降することでユビキチン修飾モチーフを濃縮した後、質量分析によってユビキチン化タンパク質とユビキチン連結を定性・定量解析する。④LUBACはNF-κB活性化に関わるので、その阻害剤はシグナル伝達や転写に影響を与えると考えられる。そこで、A315T-TgマウスのHOIPIN-8処理・未処理マウスのSC/MCを用いてシングルセルRNAseqを行う。その結果を解析することによって、どの細胞でどのような遺伝子転写変動が起こるのか、どの細胞間で相互作用をしている可能性があるか解明する。scRNAseqから推定された遺伝子変動は定量PCRで確認する。⑤LUBACとともに複雑型ユビキチン鎖生成に寄与する可能性のある候補E3について、免疫組織染色法にて解析する。これによって、M1鎖生成抑制剤（HOIPIN-8）のALS病態進行に対する薬効を解明する。
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