| Project/Area Number |
22K18385
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 51:Brain sciences and related fields
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
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Principal Investigator |
徳永 文稔 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 教授 (00212069)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
及川 大輔 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20455330)
清水 康平 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 講師 (70727073)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000)
Fiscal Year 2025: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000)
Fiscal Year 2022: ¥7,150,000 (Direct Cost: ¥5,500,000、Indirect Cost: ¥1,650,000)
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| Keywords | 直鎖状ユビキチン鎖 / 筋萎縮性側索硬化症 / TDP-43 / ユビキチンリガーゼ / 阻害剤 / 疾患モデルマウス / 神経細胞内封入体 / タンパク質 / ユビキチン / 酵素 / 神経変性疾患 / 疾患修飾薬 / 細胞質封入体 / 炎症 / 化合物探索 |
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| Outline of Research at the Start |
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は運動ニューロンが変性することで筋力低下を引き起こす神経変性疾患で、現在のところ有効な治療法はないため、ALS発症に至る細胞機構の基礎解明を基盤とした創薬シーズ探索への挑戦は急務である。我々は、ALS患者神経細胞内封入体に多様な連結からなる複合型ユビキチン鎖が含まれていることを見出しており、これがALS発症の細胞機構に関わる可能性を着想している。そこで本研究では複合型ユビキチン鎖を生成するユビキチンリガーゼ(E3)を同定するとともに、E3を標的とした抑制剤を探索し、細胞やALSモデルマウスを用いて薬効を解析する。これによってALS発症機構の基礎医学的解明に貢献する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
筋萎縮性側索硬化症(ALS)やアルツハイマー病など神経変性疾患では構造異常タンパク質がユビキチン陽性封入体を形成し、タンパク質毒性を発揮することで神経細胞死を惹起する。ユビキチン修飾はプロテアソーム分解を引き起こすタンパク質の翻訳後修飾として見出されたが、近年ではユビキチン内の7つにLys残基に加えて、我々が見出したユビキチンのN末端Met1を介する新規「直鎖状ユビキチン鎖(M1鎖)」という8通りのユビキチン連結を駆使することで多彩な細胞機能を制御することが明らかになった。M1鎖生成は、LUBACユビキチンリガーゼによってのみ生成され、炎症や免疫制御に重要なNF-κBシグナル経路の活性化を導く。さらに我々は、OPTN家族性・孤発性ALSやアルツハイマー病のtauタンパク質封入体において、M1鎖、K48鎖、K63鎖など多様なユビキチン鎖が混在することを突き止め、複合型ユビキチン鎖の生成が病態進行に関わる可能性を見出した。これはM1鎖を含む複合型ユビキチン鎖生成がALSなど神経変性疾患に対する創薬標的としても重要であることを示唆している。そこで我々は、LUBACに対する阻害剤(HOIPIN-8)を独創的に開発した。本研究では、HOIPIN-8をALSモデルマウス（TDP-43-A315T-Tg）に投与し、増殖・生存、炎症、ユビキチン陽性凝集体形成、運動機能への影響を解析し、ALSの進行を改善する治療薬シーズを創出することを最大の目的とする。これを遂行するために、①ALSにおける複合型ユビキチン鎖生成に関わるE3の探索、②複合型ユビキチンコードを標的とした化合物探索、③細胞レベル、ALSモデルマウス、疾患組織を用いた複合型ユビキチン鎖の解析を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々は以前、Neuro2a細胞にTDP-43のC末端領域を発現するとユビキチン陽性封入体を形成し、HOIPIN-8存在下では凝集体形成を抑制することを突き止めた(Cells, 2022)。そこで今回、TDP-43-A315T-TgマウスにHOIPIN-8を経鼻投与することで、in vivoでHOIPIN-8の薬効を解析した。TDP-43-A315T-Tgの大脳運動野や脊髄中では、M1鎖のみならずK48鎖やK63鎖を含む複合型ユビキチン陽性封入体形成が週齢とともに増加することを見出した。TDP-43-A315T-TgマウスにHOIPIN-8を経鼻投与すると、複合型ユビキチン陽性封入体形成が抑制されるとともに、後肢握力低下など一部の運動機能の低下を抑制することを突き止めている。さらに我々は、HOIPIN-8投与によってリン酸化TDP-43、神経炎症（ミクログリア）の減少、後肢筋萎縮を抑制することを明らかにした。これらの結果から、TDP-43-A315T-Tgマウスの大脳運動野ではM1鎖陽性封入体が形成され、その後K48鎖やK63鎖陽性封入体が形成されると示唆され、LUBAC阻害剤(HOIPIN-8)をシーズとすることで、ALSに対する新規疾患修飾薬開発に至る可能性が示され、論文作成直前に到達したたため、概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、ALSモデルマウスの神経組織を用いたscRNA-seqなどの網羅的解析により、HOIPIN-8投与によりどのような細胞機能・シグナル経路が回復するかを探索し、その分子機序を解明し、神経細胞やグリアなど細胞間相互作用を明らかにするとともに、複合型ユビキチン鎖が関連すると予想されるプロテアソーム分解、オートファジー、シグナル伝達の変動を明らかにする。さらに、ALSにおける複合型ユビキチン鎖生成に関わるE3の探索として、全ヒトゲノム規模タンパク質間相互作用解析技術(24K-HUPA)を用いて新規LUBAC協調性E3を同定する。直鎖(LUBAC)とK48鎖（RNF126）生成E3は見出しているので、特にK63鎖生成E3候補を探索する。また、複合型ユビキチンコードを標的とした化合物探索として、澤崎グループのハイスループット解析システムを用いて、東京大学創薬機構の化合物ライブラリーから新規同定E3の活性阻害剤、及びLUBACとの相互作用阻害剤(PPI)の探索に挑戦する。さらに、細胞レベル、ALSモデルマウス、疾患組織を用いた複合型ユビキチンの解析として、複合型ユビキチン鎖のin vitro生化学解析、神経細胞レベルでの炎症・自然免疫応答、細胞死、凝集体形成を明らかにする。また、同定化合物を神経細胞やTDP-43-A315T-Tgマウスに投与し、増殖・生存、炎症、ユビキチン陽性凝集体形成、運動機能への影響を解析する。さらに、ALS患者由来標本を用いて、新規E3の関与について解明する。
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