| Project/Area Number |
22K18430
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 64:Environmental conservation measure and related fields
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
新妻 靖章 名城大学, 農学部, 教授 (00387763)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
湊 健一郎 名城大学, 農学部, 教授 (10341728)
細田 晃文 名城大学, 農学部, 准教授 (50434618)
大浦 健 名城大学, 農学部, 教授 (60315851)
伊藤 元裕 東洋大学, 生命科学部, 准教授 (80612332)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥25,610,000 (Direct Cost: ¥19,700,000、Indirect Cost: ¥5,910,000)
Fiscal Year 2025: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2023: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
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| Keywords | マイクロプラスチック / トリIgY抗体 / 高分解能GC/MS / ポリスチレン / 腸内細菌 / 海鳥 / 抗マイクロプラスチック抗体 / 免疫抗体反応 / 熱分解GC/MS 分析 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では，プラスチックの一斉分析が可能な熱分解GC/MS分析から生体組織内に取り込まれているプラスチックを定性ならびに定量的に分析し，海鳥類のプラスチック摂取を免疫抗体反応で評価する方法を新規に開発し，海鳥類を含む海洋捕食動物への適用を目指す．海鳥の体内でどのような遺伝子発現が起こっているかについて，RNA-seqを用いて定量的な解析を行い，マイクロプラスチックの生体への影響を明らかにする．これらを新規の手法を日本沿岸で繁殖する海鳥類に適用することで，マイクロプラスチック汚染による海鳥類の健康被害リスクマップを構築する．
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| Outline of Annual Research Achievements |
マイクロプラスチック(MP)の摂食状況を把握するため，外洋性のコアホウドリ20羽と沿岸性のウミネコ20羽について胃内容を分析と化学分析用の試料を採集した．コアホウドリについては全ての個体からMPが検出されたが，ウミネコについては約3割の個体からMPが検出された．ELISA法によるMP測定に向けて異なる生態を持つウミネコ，オオセグロカモメ，ウトウの血液サンプルを70個体から採取した．
前年に得られた海鳥抗プラスチック血清を用いて，ELISA法によるMP測定手法を確立するために，異なる材質によりコーティングされたポリスチレンプレートを用いて，その特異性を確認した．その結果，ポリスチレン(PS)に対して特異的に反応する抗体（トリIgY抗体）が検出された．そのため，どのような鳥血清においても，MPが検出できる可能性が示された．
高分解能GC/MSによる微量サンプル中のMPを定量分析する手法を検討した．分析装置であるGC/MSの注入部にパイロライザーを設置し，MPの熱分解で生じた分子鎖の分析を行った．その結果，ポリエチレン(PE)，ポリプロプレン(PP)，PSで熱分解物を確認でき，計算精密質量との誤差はすべて10ppm未満となった．
ウズラの飼育実験により，粉末状PSの投与によるMPの体内への摂取と腸内細菌群集への影響を調べた．ウズラ各５羽を粉末状PS投与区（試験区），非投与区（対照区）として120日間飼育した．飼育終了後に臓器と血液の採取，および採取した腸管の生理食塩水洗浄液を凍結保存した．糞および腸管洗浄液からDNAを抽出し，16S rRNA遺伝子に基づいた次世代シークエンス（NGS）解析を行った．その結果，MP投与前の糞，MP投与後の糞，腸管洗浄液の各サンプル間で群集構造の類似がみられ，試験区・対照区間では構造の違いがみられた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究分担者と緊密な連携をとり，野外調査を実施した．これにより，ELISA法に供するための血液を多数の海鳥種から収集することに成功した．また，プラスチックの摂取の有無を調べるための海鳥類の胃内容物を実施し，海鳥類の生体組織内に取り込まれているプラスチックを定量的に分析するための生体組織サンプルをウミネコとコアホウドリから採集した．
海鳥類のプラスチック摂取を免疫抗体反応で評価手法の開発においては，異なる材質のコーティング剤を使用したポリスチレンマイクロプレートを用いて，海鳥抗プラスチック血清の特異性を調査した．その結果，抗ポリスチレン抗体による，認識特異性が明らかとなった．現在より効果的な検出方法を確立するために，上記のようにプレート上の化学物質と直接反応させる直接法の他，抗プラスチック抗体をプレートに結合させて，それにマイクロプラスチックを反応させ，さらに抗体で挟んで，より反応特異性を向上させたサンドイッチ法の適用を検討している．
生体組織内に取り込まれているマイクロプラスチックを定性・定量分析については，分析装置であるGC/MSの注入部にパイロライザーを設置し，MPの熱分解で生じた分子鎖の分析を行った．その結果，PE，PP，PSのすべてで熱分解物を確認できた．定量イオンはノイズの影響を減らすためにピーク強度が大きく，他の物質の影響を減らすために質量が大きいものを選択した．定量イオンの測定精密質量はPEがm/z 83.0854，PPがm/z 83.0854，PSがm/z 91.0541となり，生体試料の分析の準備は整った．
生体内でどのような遺伝子発現が起こっているかの解析については，モデル生物をウズラとし，飼育実験を行った．その結果，試験区・対照区間では腸内細菌群集構造の違いがみられ，MP投与の有無は腸内細菌群集に影響を与えたことが示唆された．
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は，今年度と同様の調査を更に精力的に実施し，今後の実験室的な本分析に供する十分量のサンプルを採取する．新型コロナウイルス感染症の終息が5月初旬となったため，一部繁殖地では，調査の準備が遅れた．次年度は，特にこれまで調査が困難であった離島の海鳥類の調査実施に向けて，現地での情報収集や関係作り，調査を進めていく予定である．引き続き繁殖地周辺部海岸において，プラスチックの採集を行い，繁殖地周辺でのプラスチックの汚染状況を確認し，海鳥類が摂取しているプラスチック類と比較する．
海鳥類のMP摂取を免疫抗体反応で評価する方法の開発においては，ELISAサンドイッチ法による，MPの定量方法を確立する．このことにより，より正確なMP量の定量が実現できる．そのため，海鳥血清中よりIgY抗体を分離して，それらの精製を進める．本抗体の化学構造（アミノ酸配列）を解析して全構造を明らかにすれば，その情報を基に大腸菌を使った組換え体を作成することも可能になる．大量の抗体作製にはウサギ，マウス等実験動物の使用が欠かせないが，本方法を採用できれば，その必要が無くなるため，並行してアプローチしていく．
海鳥の生体組織内にプラスチックが取り込まれているのかについて，これまでに収集した試料の分析用の準備を進め，MPの一斉分析が可能な熱分解GC/MS分析による定量的な解析を進める．また，他のプラスチックの定量イオンを決定し，生体試料中のMPを網羅的に定量分析を行う予定である．
鳥類へのMP投与が腸内細菌群集構造に影響することが示唆されたので，腸内細菌群集構造の変化を通して，ウズラの生体にどのような影響を及ぼすかについて飼育実験と解析を進める．
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