| Project/Area Number |
22K18919
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 27:Chemical engineering and related fields
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
中野 秀雄 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00237348)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
ダムナニョヴィッチ ヤスミナ 名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (00754673)
兒島 孝明 名城大学, 農学部, 准教授 (40509080)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
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| Keywords | 無細胞蛋白質合成系 / ヒト抗体 / ウサギ抗体 / エピトープマッピング / 抗体 / エピトープ / リボソームディスプレイ / 無細胞タンパク質合成系 |
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| Outline of Research at the Start |
ヒト体内に存在するB細胞が産生する抗体分子は、感染防除や予防、がん細胞除去な どを担う一方、自己免疫疾患やがん細胞増殖にも関わるなど、多面的な機能を有することが知られている。抗体の標的分子は可変領域の配列で決まっているのであるが、その配列と標的であるエピトープを網羅的に解析する手法は存在せず、それらの関係性は不明のままである。本研究では、エマルジョン中での極微細反応場や無細胞タンパク質合成系、さらには次世代シーケンスやバイオインフォマティクスを駆使することで、抗体配列とエピトープを迅速安価に解析する新たな方法論を開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
標的分子に結合するモノクローナル抗体を網羅的に取得することと、取得抗体のエピトープを決定することは、免疫系を理解し、それらを医療だけでなく様々に産業利用していくためには大変重要な技術課題である。ともに一つの抗体に対して作業を行う場合でも数ヶ月単位の時間が要する作業であり、相当のコストがかかる。したがって生体内に存在する10の16から18乗にものぼるレパートリーのうち、ある特定の抗原に対するほんの少しもの抗体とそのエピトープを「網羅的」に解析することは全く不可能であった。本研究では、抗体配列とそのエピトープ、網羅的に解析することを可能にする技術課題に取り組んでいる。昨年度に引き続き、本年度は、1)リボソームディスプレイを用いたウサギおよびヒトFab抗体のライブラリー構築技術の開発とモデルスクリーニングの実施、2)リボソームディスプレイ、次世代シーケンスとバイオインフォマティクスによるエピトープ推定技術の開発に取り組んだ。1)については、ヒト・ウサギの抗体を短鎖Fabとして網羅的にリボソーム上に提示して、各種抗原に対するスクリーニングを行った。腸内細菌を抗原としてそれに結合できるヒト抗体配列を、リボソームディスプレイにより濃縮し、大腸菌にクローニングして塩基配列を解析し、無細胞タンパク質合成系によりFabとして解析を行なった。またウサギに関しても標的産物に結合する抗体配列の濃縮に成功した。２）については、ランダムペプチドライブラリーをリボソーム上に提示し、モデルとした無細胞蛋白質合成系により合成したFabに結合するペプチド配列を濃縮し、次世代シーケンス解析と独自に作成したPythonプログラムを用い、標的分子中からエピトープを推定する手法を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2022年度末の時点では、
1)リボソームディスプレイ法により抗原に対する抗体セレクションのプロセスを確立する。2)無細胞タンパク質合成系により合成したFab抗体に対してリボソームディスプレイによりエピトープマッピングを行う際の条件検討；3)上記のFab抗体を多サンプル(96種類程度)同時解析行うための、条件検討を行う。；4) エマルジョン中での抗体L鎖H鎖mRNA結合反応の条件を検討する。としていたが、1)の条件検討の際に、副産物のDNA断片の増幅が顕著になったため、その対策に時間をとられてしまい、検討予定の3)と4)の実験を行うことができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究成果をもとに、
1)無細胞タンパク質合成系により合成したFab抗体を多サンプル(96種類程度)同時解析行うための、条件検討を行う。
2)エマルジョン中での抗体L鎖H鎖mRNA結合反応の条件を検討する。
3) 2)の条件で増幅した天然ペアの抗体L鎖H鎖を有する短鎖Fab抗体のリボソームディスプレイ法を確立する。
4)3)でスクリーニングした抗体のエピトープをハイスループットに合成する方法論を確立する。
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