革新的機能的ヒト抗体配列ーエピトープのハイスループット解析技術開発

Research Project

Project/Area Number	22K18919
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 27:Chemical engineering and related fields
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	中野秀雄名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00237348)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	ダムナニョヴィッチヤスミナ名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (00754673) 兒島孝明名城大学, 農学部, 准教授 (40509080)
Project Period (FY)	2022-06-30 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2022: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Keywords	抗体 / エピトープ / リボソームディスプレイ / 無細胞タンパク質合成系
Outline of Research at the Start	ヒト体内に存在するB細胞が産生する抗体分子は、感染防除や予防、がん細胞除去などを担う一方、自己免疫疾患やがん細胞増殖にも関わるなど、多面的な機能を有することが知られている。抗体の標的分子は可変領域の配列で決まっているのであるが、その配列と標的であるエピトープを網羅的に解析する手法は存在せず、それらの関係性は不明のままである。本研究では、エマルジョン中での極微細反応場や無細胞タンパク質合成系、さらには次世代シーケンスやバイオインフォマティクスを駆使することで、抗体配列とエピトープを迅速安価に解析する新たな方法論を開発する。
Outline of Annual Research Achievements	標的分子に結合するモノクローナル抗体を網羅的に取得することと、取得抗体のエピトープを決定することは、免疫系を理解し、それらを医療だけでなく様々に産業利用していくためには大変重要な技術課題である。ともに一つの抗体に対して作業を行う場合でも数ヶ月単位の時間が要する作業であり、相当のコストがかかる。したがって生体内に存在する10の16から18乗にものぼるレパートリーのうち、ある特定の抗原に対するほんの少しもの抗体とそのエピトープを「網羅的」に解析することは全く不可能であった。本研究では、抗体配列とそのエピトープ、網羅的に解析することを可能にする技術課題に取り組んでいる。本年度は、第一段階として1)リボソームディスプレイを用いたウサギおよびヒトFab抗体のライブラリー構築技術の開発とモデルスクリーニングの実施2)リボソームディスプレイ、次世代シーケンス、とバイオインフォマティクスによるエピトープ推定技術の開発に取り組んだ。1)については、ヒト・ウサギの抗体を網羅的にリボソーム上に提示できるプライマー設計とそのモデルスクリーニングを行った。腸内細菌を抗原としてそれに結合できるヒト抗体配列を、リボソームディスプレイにより濃縮した。２）については、ランダムペプチドライブラリーをリボソーム上に提示し、モデルとした抗タグ抗体に結合するペプチド配列を濃縮し、次世代シーケンス解析と独自に作成したPythonプログラムを用い、標的分子中からエピトープを推定する手法を開発した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 抗体配列とそのエピトープを網羅的に解析するFunctional Repertoire-Epitope Estimation Technology (FREE Tech)を実現するため、以下の実験を計画した、 1) 極微量スケールの水相反応場を大量にW/Oエマルジョンで作製し、その中で一細胞溶解、オーバーラップエクステンションPCRを行うことで、各B細胞が元来有しているL鎖とH鎖のDNAを結合させる条件を検討する。その後結合したL鎖H鎖からなる抗体を提示するリボソームディスプレイを行い、抗原(ウイルスやがん細胞))に結合する配列を濃縮する。 2)大腸菌にクローニング、抗体を発現させELISAなどにより抗原に結合する抗体とそのDNAを、数百個単位で取得する。その後抗原結合能を有する数百の抗体配列とそのエピトープをランダムペプチドを提示するリボソームディスプレイやcDNAディスプレイを用いて、各抗体に結合するペプチドのDNA配列濃縮、抗体DNA配列とペプチドDNA配列を結合して、次世代シーケンサー(NGS)解析により解析するシステムを開発する。また膨大なNGSデータより、抗体配列とそのエピトープ配列のデータベースを作成する。 3) よりハイスループットなシステムを構築するため、大腸菌にクローニングする代わりに、エマルジョン技術を駆使した解析技術を開発する。初年度は、上記の１）の項目のうち、リボソームディスプレイに関する基盤技術を確立した。さらに2)のエピトープマッピングに関しての主要技術・解析プログラムを開発しており、おおよそ順調に推移していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	1)リボソームディスプレイ法により抗原に対する抗体セレクションのプロセスを確立する。 2)無細胞タンパク質合成系により合成したFab抗体に対してリボソームディスプレイによりエピトープマッピングを行う際の条件検討 3)上記のFab抗体を多サンプル(96種類程度)同時解析行うための、条件検討を行う。 4) エマルジョン中での抗体L鎖H鎖mRNA結合反応の条件を検討する。