Super-resolution fluorescence lifetime imaging for analysis of mitochondrial membrane potentials at the cristae level

Research Project

Project/Area Number	22K19108
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 37:Biomolecular chemistry and related fields
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	多喜正泰名古屋大学, 物質科学国際研究センター(WPI), 特任准教授 (70378850)
Project Period (FY)	2022-06-30 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2023: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000) Fiscal Year 2022: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Keywords	ミトコンドリア内膜 / クリステ構造 / 超解像イメージング / 蛍光寿命イメージング / 脂質酸化 / ミトコンドリア膜電位 / 蛍光プローブ / 定量解析
Outline of Research at the Start	ミトコンドリア膜電位の恒常的な維持は，細胞活動に不可欠であり，この過程を理解することは生物学的に重要な課題である．最近の研究により，膜電位はクリステ毎に異なっており，それそれが独立した生体エネルギーユニットとして機能していることが示唆された．しかし，現技術ではクリステ毎の経時的な膜電位動態をリアルタイムで追跡することは不可能である．本研究では，超耐光性のミトコンドリア膜電位プローブを創製し，超解像蛍光寿命イメージングによって個々のクリステの膜電位を定量的に解析する技術を確立することを目的とする．得られる結果から，ミトコンドリア機能維持におけるクリステの独立性について検証する．
Outline of Annual Research Achievements	ミトコンドリアは，膜形態をダイナミックに変化させながらアポトーシスの制御やカルシウム貯蔵など，多岐にわたる細胞機能を精密にコントロールしている．本課題では，第2世代のミトコンドリア内膜標識剤として，MitoPB Redを開発した．MitoPB Redは赤色領域に蛍光を有することに加え，MitoPB Yellowに比べさらに大きな環境応答性を示すことが特徴である．これにより，より長波長の775 nmによる誘導放出が可能となり，明瞭なクリステ構造を捉えることができた．さらに，MitoPB Redは，脂質組成の違いによって誘起される膜極性環境の違いを感受して，異なる蛍光寿命を与えることを見出した．蛍光寿命顕微鏡 (FLIM) でミトコンドリアを観察すると，単一のミトコンドリアにおける内膜組成の不均一性を捉えることに成功した．ミトコンドリアの形態は，膜組成とも関連する．光照射した細胞，あるいはアポトーシス誘導剤で処理した細胞は，脂質膜の酸化に伴い，ミトコンドリアの膨潤が認められる．この様子をFLIMで観察したところ，酸化前に比べて蛍光寿命が長くなっている様子が認められた．これは，不飽和脂質が酸化されることで，結果的に飽和脂質濃度が高くなり，内膜の極性が低下したことに起因する．また，内膜酸化の様子をタイムラプス観察したところ，酸化はすべてのミトコンドリアで同時におこるのではなく，ミトコンドリアの一部が酸化されると，膜特性変化がそのミトコンドリア全体に広がっていく様子が認められた．本現象についてはさらなる検証が必要であるが，MitoPB Redは内膜特性を可視化できる優れたツールであることが示された．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 2022年度は，環境応答性ミトコンドリア内膜標識剤の開発と，その機能評価が当初の研究計画であったが，①ミトコンドリア内膜酸化による脂質特性の変化，②オルガネラ接触領域における内膜流動性の向上，および③超解像蛍光寿命イメージング (STED-FLIM) によるクリステ観察など，研究計画を上回る研究を遂行することができた．ここで得られた知見を分子設計指針にフィードバックし，より高感度な環境応答性プローブを開発している段階にある．一方で，蛍光寿命の膜電位依存性はまだ検証できていないため，これは2023年度の課題となる．これらの研究成果を総合的に鑑み，当初の計画以上に進展していると判断した．
Strategy for Future Research Activity	これまで得られた結果を踏まえ，新たな内膜標識剤の開発に着手している．ここで得られる化合物については，各種光物性や耐光性などの基本的な評価に加え，ミトコンドリア内膜特異性や細胞毒性を実施し，プローブとしての有用性を確認する．最も重要なポイントは，蛍光寿命の膜電位依存性の評価である．2022年度に巨大リポソーム作成装置を購入したため，これを用いて膜電位と蛍光寿命の相関性の評価，および検量線の作成を行う．また，STED-FLIM画像の取得条件も最適化し，クリステ毎の膜電位の定量解析に挑む．