| Project/Area Number |
22K19129
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
和地 正明 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (90192822)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
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| Keywords | ジペプチド / アミノ酸 / 代謝制御 / カタボライト抑制 / GcvB sRNA / グルタミン / アラニルグルタミン / GcvB small RNA / 大腸菌 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究ではGcvB small RNAを介したジペプチドによるアミノ酸代謝抑制機構の全容を解明することを目指す。ジペプチドの分解に関与するペプチダーゼの多重欠損株Δpeps株を用いて、アミノ酸の代謝（生合成や取り込み、排出など）遺伝子についてジペプチドの添加の有無により発現量の変化を解析する。さらにジペプチドやトリペプチド、テトラペプチド等のオリゴペプチドについてアミノ酸代謝抑制活性を検定し、本制御系のシグナル分子の実体を解明する。得られた知見をもとに、細胞内ジペプチド濃度が上昇してもアミノ酸生合成が抑制されない株を構築し、ジペプチドの発酵生産株の育種に応用する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸菌のグルタミン要求性変異株(ΔglnA株)をM9グルコース最少培地にて培養し、ジペプチドであるアラニルグルタミンと単体のグルタミンを添加した時の細胞の増殖と、添加したジペプチド及びアミノ酸の消費速度を測定した。グルタミン源として10 mMアラニルグルタミンと10 mMグルタミンをそれぞれ単独で加えたときは、アラニルグルタミンを添加した時の方がグルタミンを添加した時よりも短いラグ時間で増殖を開始し、その後の増殖速度も速かった。この時、アラニルグルタミンはグルタミンより早く消費された。興味深いことに、10 mMグルタミンに少量(0.5 mM)のアラニルグルタミンを添加すると、10 mMアラニルグルタミン添加時と同じように増殖した。このことから、それぞれ単独で加えた場合にはアラニルグルタミンはグルタミンより早く消費されること、また少量のアラニルグルタミンはグルタミンの消費を促進することが示唆された。まずこの現象にGcvB sRNAが関与しているかを調べた。その結果、gcvB欠損株でも同様の現象がみられたことからGcvB sRNAは関与していないことが明らかになった。そこで、この条件でジペプチドにより発現の変化する遺伝子の解析を行った。グルタミン代謝に関わる遺伝子の発現を定量RT-PCRにより測定したところ、グルタミンに少量のアラニルウルタミンを添加するとグルタミンの取り込み担体をコードするglnHPQ遺伝子の発現がグルタミン単独添加時と比べて数倍に上昇していることが判明した。このことから少量のアラニルグルタミンはグルタミンの取り込みを促進していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画ではペプチダーゼ多重欠損株Δpeps株を用いてジペプチドの有無により発現量が変化する遺伝子をRNA-Seq解析により同定する予定であったが、2022年度の実験結果を踏まえて、大腸菌グルタミン要求性変異株(ΔglnA株)にジペプチドであるアラニルグルタミンと単体のグルタミンを添加した時の増殖とアミノ酸代謝に対する影響を調べるための新しい実験系の構築を行った。特にグルタミン代謝に関わる遺伝子について定量RT-PCRにより発現量の変化を調べた。変更した計画にそってほぼ予定通りに実験を進めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
グルタミン要求性変異株(ΔglnA株)にグルタミンと少量のアラニルグルタミンを添加した時に、グルタミン取り込み単体の発現が顕著に増大するメカニズムの解明を目指す。特に窒素代謝関連転写因子等の遺伝子に注目して定量RT-PCR解析により発現量の変化を調べる。まずは窒素飢餓を感知する２成分制御系をコードするntrBC遺伝子や窒素応答シグマ因子をコードするrpoN遺伝子の関与について調べる。
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