| Project/Area Number |
22K19137
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
二神 泰基 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (60512027)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | 白麹菌 / トランスポーター / 過剰発現 / 有機酸 / 2-オキソグルタル酸 / ジカルボン酸 / 黄麹菌 / 麹菌 / 輸送体 |
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| Outline of Research at the Start |
微生物を用いて有用物質をつくる発酵産業において、細胞内で生産された目的の代謝物を細胞外に排出させるプロセスには回収を容易にするというメリットがある。また、細胞内に代謝物が蓄積して生産に関与する酵素活性を阻害したり、細胞毒性を発揮したりすることを防ぎ、生産を促進する要因にもなる。本課題では麹菌の機能未知輸送体の過剰発現ライブラリーを構築し、有用物質の高生産をもたらす輸送体を探索する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、麹菌において機能未知輸送体を解析し、有用物質の高生産をもたらす排出・取り込み輸送体を同定することである。本年度は、まず、昨年度に引き続き白麹菌Aspergillus luchuensis mut. kawachiiを宿主とする過剰発現実験により、有機酸の排出輸送体のスクリーニングを実施した。その結果、ChlHの過剰発現により2-オキソグルタル酸とフマル酸、ChlKの過剰発現により2-オキソグルタル酸、リンゴ酸、コハク酸を培養上清に高濃度に蓄積することが明らかになった。これらの中でも特に2-オキソグルタル酸が高濃度であり、ChlHとChlKの過剰発現による培養上清中の2-オキソグルタル酸濃度はそれぞれ約25 mMと50 mMに達した。そこで、ChlHとChlKが他のAspergillus属糸状菌でも同様の機能を示すのかを調べるために、黄麹菌Aspergillus oryzaeを宿主として、α-アミラーゼ遺伝子のプロモーターの制御下で白麹菌に由来するchlH遺伝子とchlK遺伝子を過剰発現させたところ、白麹菌発現系と同様に細胞外の2-オキソグルタル酸濃度が顕著に上昇した。また、白麹菌においてGFP融合タンパク質発現株の観察を行い、ChlHとChlKが細胞膜に局在することが示唆された。以上の結果から、ChlHとChlKが2-オキソグルタル酸をはじめとする細胞膜局在型のジカルボン酸排出輸送体である可能性が示唆された。また本年度は、これらの輸送体の機能解析をタンパク質レベルで実施するための発現精製系を検討した。まず、クエン酸排出輸送体CexAをモデルとして、大腸菌を宿主としたCexAの発現系を構築したが、発現誘導をかけると大腸菌の増殖が阻害されCexAの発現は認められなかった。このことから、大腸菌発現系以外のタンパク質発現系を利用する必要があることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、昨年度に引き続いて白麹菌において機能未知輸送体の過剰発現株の取得と解析を行い、培養上清にジカルボン酸を蓄積するようになる推定輸送体ChlHとChlKを見出した。特に2-オキソグルタル酸の推定排出輸送体については従来報告がないため注目した。そこで今後はこれらの推定輸送体を解析することで、新規性の高い輸送体の機能について明らかにできる可能性がある。以上のことから、おおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、昨年度に引き続いて白麹菌のcexA遺伝子破壊株を宿主とする過剰発現系を用いた有機酸の排出輸送体のスクリーニングを継続して実施する。これまでに構築した過剰発現株のなかで、特に注目すべき表現型の変化が観察されたものについて、細胞外の代謝物を質量分析により解析する。これまでにChlHとChlKの他にChlA、ChlC、およびChlGを見出している。
次に本年度の実験で見出した推定2-オキソグルタル酸輸送体ChlHとChlKの詳細な機能を明らかにするための生化学的な手法による機能解析系を構築する。解析対象にはクエン酸排出輸送体CexAをコントロールとして含めて実施する。これらのタンパク質を無細胞合成系により発現させてリポソームに包埋させてプロテオリポソームを調製する。このプロテオリポソームへの14Cで標識された各種有機酸の取り込み活性を測定する実験系を構築する。また、無細胞合成系におけるCexA、ChlHおよびChlKの発現に成功した場合は、各タンパク質を精製可能かどうか検討する。以上により、これまでにスクリーニングした輸送体の詳細な機能解析を実施する。
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