植物病原糸状菌に対する「RNA農薬」の技術的基盤の構築

• Project/Area Number: 22K19181
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 39:Agricultural and environmental biology and related fields
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 中屋敷 均 神戸大学, 農学研究科, 教授 (50252804)
• Project Period (FY): 2022-06-30 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2024: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2022: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: いもち病菌 / RNA / RNAi / マイコウイルス / 生物防除

Outline of Research at the Start

本研究ではRNAの直接導入により植物病原糸状菌の防除を目指す。導入RNAはマイコウイルスのゲノムあるいはサテライトRNAを利用し、そこにターゲット遺伝子を導入したVirus Induced Gene Silencing（VIGS）による病原性低下を狙っている。
本研究の特徴は使用するマイコウイルスにあり、これらは粒子を形成せずRNAのみからなり、宿主の生育に悪影響を与えない。また、菌糸融合で伝播されるという特徴を持っている。この特徴を活かして、農生態系の中で病原性を低下させるウイルスを定着させ、病害発生抑制型の環境を構築することを最終目標とする。

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、本実験計画にある「RNA農薬」の実現に必須であるマイコウイルスのクローニングおよびin vitro転写系の構築を行った。RNA農薬の土台となる因子の候補は、これまでにRNAのみで感染が起こると報告されているDiaporthe ambigua RNA virus1（DaRV1）と類縁のPyricularia oryzae umbra-like virus 1（PoUV1）と命名したウイルスである。PoUV1の5'RACEおよび3'RACEを行い末端配列を決定した後に全長cDNAをクローニングした。またこのcDNAにPCRを用いてT3およびT7プロモーター配列を付加してin vitroで二本鎖のウイルスRNAを合成できることを確認した。現在、このdsRNAをリポソーム、PEG等を用いて、菌糸や胞子に導入することを試みている。
また、より簡易な方法としてPoOLV1のサテライトRNAを用いた「RNA農薬」の開発も試みており、二種のサテライトRNA（ARNA１およびARNA3）の全長cDNAのクローニングを試みている。ARNA1については、クローニングが済んでおり、PoUV1と同様にT7やT3プロモーターを付加してRNAの合成に成功した。ARNA3は過去にRNA-seqからインシリコで構築した配列に間違いがあることが判明し、現在これを再構築してクローニングを試みている。ARNA1に関しては配列内にモデル遺伝子であるGFPなどを組込み、実際に遺伝子サイレンシングを誘導できるか、そのためのコンストラクトを現在作成しているところである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究で提唱している「RNA農薬」の開発に必須なウイルスの全長cDNAに成功しており、1年目の成果としては順調である。

Strategy for Future Research Activity

今後の課題としては、RNAによりどれくらいの効率で感染が起こるのか、マイコウイルスを用いたVirus-Induced Gene Silencing(VIGS)が本当に可能なのか、またウイルス保有株と非保有株の間の菌糸融合による伝播はどれくらいの効率で起こるのかといった点が残っている。本研究のアイディアの実現のためにこれらの問題点に一つ一つ取り組む予定である。