アルボウイルスの特殊なゲノムRNA構造の解析と媒介性の規定要因としての検証

Research Project

Project/Area Number	22K19185
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 39:Agricultural and environmental biology and related fields
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	大手学東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (20386717)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	嘉糠洋陸東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (50342770)
Project Period (FY)	2022-06-30 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2022: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Keywords	ヤブカ / デングウイルス / フロックハウスウイルス / RNA / アルボウイルス / RNA二次構造 / 節足動物媒介性 / RNA顆粒
Outline of Research at the Start	アルボウイルス(節足動物媒介性ウイルス)はヒトや家畜に感染症を引き起こすが、媒介者となる蚊などの節足動物に対しては病原性を示さない。これは、節足動物によるウイルス媒介を引き起こす重要な性質であるが、その詳しい仕組みについては不明な点が多い。本研究課題では、この節足動物媒介性を規定するウイルスの持つ特性を明らかにする。申請者は、これまでの研究で得た知見を元に、ウイルスのゲノムRNAに形成される特殊な高次構造が、節足動物媒介性に寄与するという仮説を立てた。本研究では、この検証実験を中心に、アルボウイルスRNAに特殊な高次構造が誘導される機構の解明と、アルボウイルスを媒介しない蚊系統の作出を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	我々が発見したプラス鎖RNAウイルスに誘導される特殊なRNA構造について、その詳細を明らかにすることを目的とした。この構造を認識する抗体を用いた細胞染色により、デングウイルスの複製サイトに局在するRNAがこの構造を形成することがわかった。また、昆虫ウイルスの変異解析を行うために、FHVのTrans-replication systemを開発した。ウイルスゲノムと複製酵素をそれぞれプラスミドにクローニングし、培養細胞に導入したところ、複製が確認された。特に、プラスミド導入後2日に転写阻害剤を添加すると、複製がより活発になることがわかった。また、ウイルスの複製に必要な約250塩基のゲノムRNA領域を特定し、変異解析を行った。ゲノム配列の情報解析により、分子内構造を形成することが予想された配列に変異を導入したところ、影響がみられなかった。そこで、網羅的な変異解析を行ったところ、複数のウイルスRNA分子が相互作用している可能性が示された。このシステムでは任意の配列を導入することができることができる。そこで、担体結合性アプタマーを挿入することにより、細胞内よりウイルスRNAを高純度で生成する手法を開発した。これにより、ウイルスRNAを1-2万倍濃縮することができた。この手法によって精製したウイルスRNAを用いてin vitro解析を行ったところ、RdRPにより、ウイルスRNA自体の性質が変化していることが判明した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ウイルスRNAの構造の詳細を解析する手法を複数確立することができたため。
Strategy for Future Research Activity	FHVにより得られた知見をもとに、デングウイルスRNAに形成される構造の解析を行う。担体結合性アプタマーを用いたRNA精製が可能であることが判明したため、レプリコンにアプタマーを挿入したコンストラクトを作成し、詳細な解析を行う。