アルボウイルスの特殊なゲノムRNA構造の解析と媒介性の規定要因としての検証

Research Project

Project/Area Number	22K19185
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 39:Agricultural and environmental biology and related fields
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	大手学東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (20386717)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	嘉糠洋陸東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (50342770)
Project Period (FY)	2022-06-30 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2022: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Keywords	アルボウイルス / ヤブカ / RNA / デングウイルス / フロックハウスウイルス / RNA二次構造 / 節足動物媒介性 / RNA顆粒
Outline of Research at the Start	アルボウイルス(節足動物媒介性ウイルス)はヒトや家畜に感染症を引き起こすが、媒介者となる蚊などの節足動物に対しては病原性を示さない。これは、節足動物によるウイルス媒介を引き起こす重要な性質であるが、その詳しい仕組みについては不明な点が多い。本研究課題では、この節足動物媒介性を規定するウイルスの持つ特性を明らかにする。申請者は、これまでの研究で得た知見を元に、ウイルスのゲノムRNAに形成される特殊な高次構造が、節足動物媒介性に寄与するという仮説を立てた。本研究では、この検証実験を中心に、アルボウイルスRNAに特殊な高次構造が誘導される機構の解明と、アルボウイルスを媒介しない蚊系統の作出を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	RNAウイルスはゲノムRNA内でのbase-pairingによって複雑な二次構造を形成し、様々な宿主・ウイルスタンパク質と相互作用することにより増殖する。我々は、昆虫媒介性ウイルスのRNAに、典型的な二次構造ではない特殊な高次構造が形成されることを発見した。本研究では、この高次構造について、その働きと、形成メカニズムの解明を行った。まず、その働きを明らかにするため、デングウイルスが感染したヤブカ培養細胞に高次構造形成原子が修飾された塩基を取り込ませることにより、特殊な高次構造を形成できないウイルスRNAを作成した。このウイルスの複製は減弱したことから、この構造はウイルスが効率よく複製するために形成している可能性が示された。また、その形成メカニズムを明らかにするため、ショウジョウバエ培養細胞と、自己複製能のない組み換え昆虫ウイルスを用いた実験系を確立した。このウイルスゲノムにて特殊な高次構造が形成されると推測される部位に変異を導入した。ウイルス複製を阻害しない部位について解析を行ったところ、特殊な高次構造は複数分子のRNAの相互作用により形成される可能性と、複数の箇所が形成に関与している可能性が示された。また、生化学的解析を行うため、特殊な高次構造に結合する一本鎖抗体と利用してウイルスRNAを免疫沈降する手法を開発した。その他、不安定な特殊な高次構造の固定にはメタノールとホルマリンを用いた方法が有効であることがわかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ウイルスに誘導される特殊な高次構造について、その働きと形成メカニズムに関する新たな知見が得られた。また、分子レベルでの解析のための手法を複数開発した。
Strategy for Future Research Activity	開発した新たな手法を用い、固定した特殊な高次構造を形成するRNAを単離して、構造の形成に関与するタンパク質、RNAの網羅的な同定を行う。