| Project/Area Number |
22K19186
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 39:Agricultural and environmental biology and related fields
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
竹田 篤史 立命館大学, 生命科学部, 教授 (60560779)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩川 弘宙 立教大学, 理学部, 准教授 (60710415)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
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| Keywords | ウイルス抵抗性 / RNAサイレンシング / Nicotiana benthamiana / アグロインフィルトレーション / RNAサイレンシングサプレッサー / ゲノム編集 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、「ウイルス抵抗性研究の高度化に資するゲノム編集タバコのプラットフォームの確立」を目指す。植物病理学分野でモデル植物として利用されているベンサミアーナタバコは、植物ウイルス研究の分野では、感染できるウイルス種が多いことから、RNAサイレンシングによるウイルス抵抗性と、ウイルスによるRNAサイレンシング抑制の研究に広く用いられてきた。しかし、さまざまな障害が存在するため、これまでのベンサミアーナを用いたウイルス研究では、遺伝学的解析が欠落していた。そこで、本研究では、ゲノム編集を用いることでこの現状の打破に挑み、植物病理学・植物分子生物学・生物工学分野の研究を高度化することを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、ウイルス抵抗性研究の高度化に資するゲノム編集Nicotiana benthamiana（以下ベンサミアーナタバコとする）のプラットフォームを確立することである。令和5年度には、主にDCL遺伝子のゲノム編集に関連して以下の実験を行った。
RNAサイレンシング関連遺伝子のゲノム編集について：ベンサミアーナタバコにおいて、引続きTGS経路に関与する遺伝子と、PTGS経路に関与する遺伝子のゲノム編集を試みた。TGS経路に関与するDCL3遺伝子がゲノム編集されたヌル分離個体とPTGS経路に関与するDCL2/DCL4a/DCL4b遺伝子がゲノム編集されたヌル分離個体を交配し、選抜することで、TGS経路に関与するDCL3遺伝子とPTGS経路に関与するDCL2/DCL4a/DCL4b遺伝子が全て編集された四重変異体の単離に成功した。また、ベンサミアーナタバコにおいて、PTGS経路に関与するRDR6遺伝子とSDE5遺伝子のゲノム編集にも成功した。
RNAサイレンシング関連遺伝子の機能解析について：作出したdcl四重変異体の生長に関連した表現型は、dcl2/4a/4b三重変異体と同じであった。他方、アグロインフィルトレーション実験を行ったところ、dcl四重変異体ではdcl2/4a/4b三重変異体よりも高い異種タンパク質発現能が確認された。これらの結果を基に、特許を出願した。
VSRの機能解析およびde novo TGSの経時的解析について：VSRの機能解析およびde novo TGS実験を行うために、作出したdcl変異体とGFP発現16cラインおよびルシフェラーゼ発現ラインとの交配を開始した。これまでに、ルシフェラーゼ発現dcl3変異体の選抜と固定に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゲノム編集植物の作出が順調に進んでおり、TGS経路とPTGS経路が両方とも欠損していると考えられるdcl四重変異体の単離に成功し、特許を出願することができたため、また、他のRNAサイレンシング関連遺伝子のゲノム編集も完了しつつあるため、「（２）おおむね順調に進展している。」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度の進捗状況を踏まえて、令和6年度には、以下の実験を行う計画である。
RNAサイレンシング関連遺伝子のゲノム編集について：引き続き、TGS経路に関与するRDR2, AGO4, AGO6と、PTGS経路に関与するSGS3遺伝子のゲノム編集を進める。また、RDR2とRDR6の同時破壊も進める。
RNAサイレンシング関連遺伝子の機能解析について：作出が完了したsde5変異体の機能解析と表現型観察を行う。単離したdcl変異体でsmall RNAの次世代シークエンス解析を行う。まずは芽生えを用いて解析を行う予定である。また、RDR6, DCL2, DCL3, DCL4遺伝子のクローニングを行い、一過的な相補実験系の確立を試みる。
アグロインフィルトレーションによって誘導される一過的なRNAサイレンシングの遺伝学的解析について：dcl3変異体、dcl2/4a/4b三重変異体、dcl四重変異体で、様々なサイレンシングインデューサーを用いたアグロインンフィルトレーション実験を行い、一過的に誘導されるRNAサイレンシングにおけるTGSとPTGSの役割を遺伝学的に解析する。
VSRの機能解析について：引続き、作出したdcl変異体をルシフェラーゼ発現B13植物と交配したPTGS欠損植物の選抜を継続する。作出に成功しているTGS欠損B13ラインを用いて、既知のVSRのPTGS抑制能に関する再検証を行う予定である。
de novo TGSの経時的解析について：引続き、作出したdcl三重変異体をGFP発現16c植物と交配し、PTGS欠損16c植物の選抜を継続する。完了次第、de novo TGS解析を行う計画である。
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