piRNA and spermatogenesis on reproductive isolation
| Project/Area Number |
22K19236
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
杉山 文博 筑波大学, 医学医療系, 教授 (90226481)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村田 知弥 筑波大学, 医学医療系, 助教 (60713485)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | ゲノム編集 / small RNA / piRNA / microRNA / 精子形成 / 生殖隔離 / マウス |
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| Outline of Research at the Start |
生物多様性を創出する種分化における生殖隔離機構の理解は、獣医学・畜産学・実験動物学を含め生物学におけて重要な課題である。マウスの生殖隔離は２つ遺伝座（Hst1とHstx2）に支配されており、Hst1の責任遺伝子はPrdm9であり、Hstx2は未だ同定されていない。そこで、雑種不稔マウスモデルを用い、連続する精子形成、特に減数分裂前期に着目し、piRNA及びmicroRNAを含む転写物のダイナミクスな発現様式をゲノムワイドに捉え、生殖隔離における遺伝子発現のダイナミックなプロセスの逸脱に関わる分子シグニチャーを明らかにする挑戦である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、雑種不稔マウスモデルを用い、連続する精子形成でのpiRNAを含む転写物のダイナミクスな発現様式をゲノムワイドに明らかにし、生殖隔離における雄性減数分裂停止機構の解明に挑戦することを目的としている。
2022年度は、①候補piRNA群をランダムもしくは網羅的に破壊することが可能なsgRNAベクターライブラリの開発と②生殖細胞のみで蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスの開発、を実施した。
①候補piRNA群をランダムもしくは網羅的に破壊することが可能なsgRNAベクターライブラリの開発では各候補piRNAにそれぞれ対応した17種類のsgRNA発現ベクターを構築した。これらのベクターにはpiRNAに対応するsgRNAだけではなく、切断することで蛍光タンパクが発現する切断レポーターカセットも搭載した。実際に生殖細胞でゲノム編集を生じさせる前に、各sgRNAの切断活性をマウス胚性幹細胞で評価した。切断をレポートする蛍光を発現する細胞のみを分取して、それらをシングルセルクローニングし、ゲノムDNAを抽出した。それらをクローンにおける変異をPCRもしくはサンガーシークエンスで確認したところ、sgRNA間で活性に差があったものの全てのsgRNAが標的サイトに変異誘導が可能であった。
②生殖細胞のみで蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスの開発では、生殖細胞特異的に発現することが知られているマウス内在性遺伝子の下流に、IRESでつないだEGFP遺伝子とゲノム編集エフェクター遺伝子を受精卵ゲノム編集でノックインした。ノックインが確認されたファウンダーマウスにおいて、生殖細胞でEGFPが発現することが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通りに、sgRNAベクターライブラリの構築が完了し、その活性は少なくともin vitroレベルでは確認できている。
生殖細胞をモニターでき、かつ、ゲノム編集エフェクターを発現する新規の遺伝子改変マウスの確立にも成功した。
以上の理由からおおむね順調に進展したと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度に構築したsgRNAライブラリを単一もしくはミックスし、生殖細胞でのみ蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスに導入する。そこで得られたマウスよりEGFPを発現する細胞を分取し、RNA-Seqにて発現プロファイルを明らかにするとともに病理学的検査で表現型を確認することで生殖不全に関与するpiRNAの混乱を特定することを目指す。
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Report
(1 results)
Research Products
(1 results)
