piRNA and spermatogenesis on reproductive isolation

Research Project

Project/Area Number	22K19236
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	Fumihiro Sugiyama 筑波大学, 医学医療系, 特命教授 (90226481)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	村田知弥筑波大学, 医学医療系, 助教 (60713485)
Project Period (FY)	2022-06-30 – 2024-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000) Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Keywords	ランダムミュータジェネシス / ゲノム編集 / ランダム変異 / small RNA / piRNA / microRNA / 精子形成 / 生殖隔離 / マウス
Outline of Research at the Start	生物多様性を創出する種分化における生殖隔離機構の理解は、獣医学・畜産学・実験動物学を含め生物学におけて重要な課題である。マウスの生殖隔離は２つ遺伝座（Hst1とHstx2）に支配されており、Hst1の責任遺伝子はPrdm9であり、Hstx2は未だ同定されていない。そこで、雑種不稔マウスモデルを用い、連続する精子形成、特に減数分裂前期に着目し、piRNA及びmicroRNAを含む転写物のダイナミクスな発現様式をゲノムワイドに捉え、生殖隔離における遺伝子発現のダイナミックなプロセスの逸脱に関わる分子シグニチャーを明らかにする挑戦である。
Outline of Final Research Achievements	We developed a novel method, CTRL-Mutagenesis, to induce random and diverse mutations within target genomic regions. By combining various combinations of sgRNA expression cassettes and various on-target mutations, we randomly and simultaneously introduced diverse mutations into target genomic regions and constructed a random mutant ES cell clone library consisting of 87 clones. CTRL-Mutagenesis, which can randomly introduce not only Indel mutations but also deletions into a 70 kb target genomic region, is expected to contribute to the functional analysis of non-coding genomic regions, which has not been achieved by conventional random mutagenesis methods.
Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements	生命現象を直接制御するタンパク質自体も重要であるが、その発現パターンを制御するプロモーターやエンハンサーなどのシス制御エレメントやmiRNAクラスターやpiRNA制御ドメインなどの機能エレメントも重要である。標的ゲノム領域内でのランダムミュータジェネシスは有効でが、ENUやジーントラップ法のような一般的なゲノムワイドミュータジェネシスでは、原理的にゲノム領域の欠失や一定の領域内に複数の変異を導入することはほとんどない。本研究で構築したCTRL-Mutagenesisは精子形成piRNAおよび転写物の分子ダイナミクスなどのシス制御エレメントの機能的に重要な領域の決定に貢献する。