| Project/Area Number |
22K19250
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
枝重 圭祐 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (30175228)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
越本 知大 宮崎大学, フロンティア科学総合研究センター, 教授 (70295210)
松川 和嗣 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 准教授 (00532160)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
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| Keywords | ゼブラフィッシュ / 未成熟卵子 / 凍結保存 / 高浸透圧傷害 / プロテアーゼ / 卵子 |
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| Outline of Research at the Start |
魚類の卵子/胚ではいまだに実用的な凍結保存法はない。胚や成熟卵子は細胞膜透過性が極めて低く、凍結保存に不可欠な細胞の脱水・濃縮と耐凍剤浸透が十分できないため、凍結保存は難しい。一方、未成熟卵子では細胞膜透過性はかなり高いが、高浸透圧傷害を極めて受けやすい。申請者らは、魚類卵子の高浸透圧傷害には細胞質型カルボキシペプチダーゼが関与していることを見出した。そこで、ゼブラフィッシュを用いて、未成熟卵子の高浸透圧傷害の分子メカニズムを明らかにし、その傷害を軽減することによって世界で初めて魚類卵子の凍結保存に成功することをめざす。さらに、アフリカツメガエルの未成熟卵子の凍結保存も試みる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
魚類卵子の凍結保存はいまだ成功していない。魚類の成熟卵子は細胞膜透過性が極めて低く、凍結保存は困難と考えられる。一方、未成熟卵子は細胞膜透過性は高く凍結保存に適しているが、高浸透圧傷害を極めて受けやすい。stage III中期のゼブラフィッシュ未成熟卵子を用いてプロテアーゼ阻害剤による高浸透圧傷害に対する軽減効果をしらべたところ、本傷害には細胞質型カルボキシペプチダーゼ（CCP）が関与していると示唆された。そこで、卵子で強く発現しているCCP1、CCP5、CCP6の発現をdsRNAの注入により抑制し、25℃の0.5 M sucrose液で５分間高浸透圧処理した後の生存性をしらべた。その結果、いずれのCCPも高浸透圧傷害に関与するが、特にCCP5が深く関与していることがわかった。そこで、CCPを含むメタロプロテアーゼ阻害剤である1-10フェナントロリンを卵子に注入してから25℃のガラス化保存液（30％耐凍剤、0.5 M sucrose、30％Ficoll PM-70）で１分間処理したところ、多くの卵子が死滅した。CCP阻害効果が不十分であると考えられた。次に、凍結保存の成功例がない両生類卵子についてしらべた。アフリカツメガエルの未成熟卵子（stage V）も高浸透圧感受性が高く、18℃の0.5 M sucrose液に10分間浸すとほとんどが死滅した。1-10フェナントロリンを注入すると高浸透圧傷害が大きく軽減されたことから、両生類未成熟卵子の高浸透圧傷害にもCCPが関与していると示唆された。そこで、CCP5のdsRNAを注入して発現を抑制してから高浸透圧処理すると生存性が大きく改善された。したがって、両生類卵子の高浸透圧傷害にもCCPが重要な役割を果たしていることがわかった。もし魚類卵子の凍結保存法を開発できれば、同様の方法で両生類卵子の凍結保存は可能になると考えられた。
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