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試験管内転写tRNAを用いた再構成型酵母翻訳系による非天然アミノ酸導入システム

Research Project

Project/Area Number 22K19264
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

富田 野乃 (竹内野乃)  東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 准教授 (80323450)

Project Period (FY) 2022-06-30 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Keywords生体外タンパク質合成系 / 非天然アミノ酸 / 高分子医薬 / 無細胞翻訳系 / 酵母 / 試験管内転写tRNA
Outline of Research at the Start

本研究では、近年申請者が構築した試験管内転写tRNAを用いた再構成型酵母翻訳系を利用し、高分子タンパク質内部に複数種類の非天然アミノ酸を同時に導入できるシステムを確立する。確立したシステムは、抗体医薬におけるADC (Antibody-Drug Conjugate)の開発などへ応用でき、コンピューター・モデリングや分子進化技術など様々な技術と統合されることにより、次世代高分子医薬品の開発を飛躍的に発展させると期待できる。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では,申請者が開発した再構成型酵母翻訳系(Abe, 2020; Nagai, 2021)を発展させ,非天然アミノ酸(ncAA)を蛋白質に導入するシステムを確立する.全tRNAを試験管内転写tRNA(iVTtRNA)で再構成した翻訳系を利用して遺伝暗号を拡張し,多種類のncAAを蛋白質の複数箇所に導入できる系を目指した.
再構成型酵母翻訳系を基盤として,系内の全tRNAを21種類のiVT tRNAで再構成した.当該翻訳系は,終止コドンの他,計34種類のセンスコドンがアミノ酸を指定しない空コドンとなる.従来の生体外タンパク質合成系を利用したncAA導入では,終止コドンにncAAを割り当てるため,導入するncAAの種類が制限される.更に系から翻訳終結因子eRF1を除く必要があるため翻訳が終結しない.当該翻訳系では,空コドンにncAAを割り当てることにより,複数種類のncAAをeRF1存在下でタンパク質に導入できる筈である.
はじめにモデルタンパク質ナノルシフェラーゼに,幾つかの空コドンを介してD型アミノ酸(D-Phe)やClickケミストリーアミノ酸(TCO*LysやPocLys)を導入することに成功した.続いて,抗体医薬Antibody-Drug Conjugate (ADC)の開発を指向し,ラクダ科動物重鎖抗体由来抗原結合ドメインVHHにClickケミストリーアミノ酸を導入することとした.VHHのFR領域にTCO*LysやPoc*Kを導入すれば,Clickケミストリーにより抗ガン剤等の化合物を更に結合できる.BRETを利用したVHHの合成効率及び抗原結合能の高感度な評価システムを確立し,iVTtRNAで再構成した翻訳系により活性のあるVHHの合成に成功した.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

-

Strategy for Future Research Activity

今後、空コドンを介してVHHのFR領域に複数種類のclickケミストリーアミノ酸(TCO*Kや Poc*Kなど)を導入し,さらに蛍光化合物などを結合させる予定である.

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (6 results)

All 2023 2022

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (4 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Reconstitution of Mammalian Mitochondrial Translation System Capable of Long Polypeptide Synthesis.2023

    • Author(s)
      Lee, M. and Takeuchi-Tomita N.
    • Journal Title

      Methods Mol. Biol.

      Volume: 2661 Pages: 233-255

    • DOI

      10.1007/978-1-0716-3171-3_14

    • ISBN
      9781071631706, 9781071631713
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Reconstitution of mammalian mitochondrial translation system capable of long polypeptide synthesis2023

    • Author(s)
      Muhoon Lee, Nono Takeuchi-Tomita
    • Journal Title

      Methods in Molecular Biology

      Volume: -

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Reconstituted Yeast Translation System using in vitro transcribed tRNAs2023

    • Author(s)
      Nono Takeuchi-Tomita
    • Organizer
      日本分子生物学会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Mechanism of translation termination and ribosome rescue in mammalian mitochondria2023

    • Author(s)
      Muhoon Lee, Yutong Zhang, Ruiyuan Huang, Nono Takeuchi-Tomita
    • Organizer
      日本RNA学会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Incorporation of non-canonical amino acids into protein by reconstituted yeast translation system using in vitro transcribed tRNAs2022

    • Author(s)
      Chang Liu, Takahiro Ikejirino, Ayaka Shimabukuro, Xiangyu Hong, Yuanhan Jin, Yichen Xu, Riku Nagai, Keita Hibi, Takayuki Katoh, Nono Takeuchi-Tomita
    • Organizer
      第22回日本RNA学会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Mechanism of translation initiation of leaderless mRNA in mammalian mitochondria2022

    • Author(s)
      Muhoon Lee, Nono Takeuchi-Tomita
    • Organizer
      第22回日本RNA学会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2022-07-05   Modified: 2024-12-25  

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