エピジェネティクスの基本動作原理に基づくメチロームの合成
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22K19276
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
伊藤 隆司 九州大学, 医学研究院, 教授 (90201326)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | 出芽酵母 / ゲノム編集 / DNMT5 / ナノポアシーケンシング / DNAメチル化 / 合成生物学 / 酵母 |
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| Outline of Research at the Start |
最近、人工ゲノムを設計・合成する「ゲノム合成」という研究分野が急速に発展している。しかしながら、真核生物ゲノムの機能制御に重要なエピジェネティク修飾であるシトシンメチル化までも含むゲノム（メチローム）の合成は行われていない。本研究では、エピジェネティクスの基本動作原理の実装を通して、酵母細胞内の人工ゲノムに真核生物の特徴である広域メチル化を誘導することに挑戦し、「メチローム合成」の技術基盤の創成を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
内在性のDNAメチル化を有しない出芽酵母をモデルに、ゲノムDNAへのメチル化導入（開始）と、そこからのメチル化の拡張、拡張の制限によるメチル化領域の設定、そして世代を越えたメチル化の維持を試みるのが、本研究における挑戦である。
まず、メチル化の標的部位を作出するために、出芽酵母よりもGC含量の高い大腸菌λファージの全長をHO遺伝子座に導入する系の高度化を試みた。昨年度に続いて、方法の最適化を進めて、選択マーカーなしで一気に48.5 kbを導入できる方法を確立することができた。ナノポアシーケンシングによるゲノムアッセンブリも行って正しい挿入が起きていることを確認する方法も確立した。これにより、メチル化コールによる評価系も構築できたことになる。また、こうした操作に必要なゲノム編集用プラスミドシリーズの高度化も進めた。更に、野生株とλDNA挿入株の生育に差がないことを確認した。
一方、メチル化維持において中心的な役割を期待するC. neoformans由来のDNMT5の発現系構築を進めた。GAL1プロモータ化に発現を誘導できるセントロメア型プラスミドの構築を行った。DNMT5そのものを発現するものと、bipartite SV40核移行シグナルおよび可視化用にymNeonGreenをC末端側に付加したものの２種類を構築した。更に、野生株とこれらのプラスミドを保持した株とでガラクトースによる誘導の有無に関わらず、生育に差異がないことを確認した。今後、まずは試験管内でM.SssIでメチル化したセントロメア型プラスミドを出芽酵母細胞に導入して、ナノポアシーケンシングでメチル化の維持を検討する準備を進めている。
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Report
(2 results)
Research Products
(1 results)
