エピジェネティクスの基本動作原理に基づくメチロームの合成

• Project/Area Number: 22K19276
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 伊藤 隆司 九州大学, 医学研究院, 教授 (90201326)
• Project Period (FY): 2022-06-30 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000); Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
• Keywords: ゲノム編集 / DNAメチル化 / 合成生物学 / 酵母

Outline of Research at the Start

最近、人工ゲノムを設計・合成する「ゲノム合成」という研究分野が急速に発展している。しかしながら、真核生物ゲノムの機能制御に重要なエピジェネティク修飾であるシトシンメチル化までも含むゲノム（メチローム）の合成は行われていない。本研究では、エピジェネティクスの基本動作原理の実装を通して、酵母細胞内の人工ゲノムに真核生物の特徴である広域メチル化を誘導することに挑戦し、「メチローム合成」の技術基盤の創成を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

出芽酵母ゲノム中にメチル化を導入（開始）し、拡張・制限・維持を行うのが本研究の挑戦である。
これらを行うためのゲノム領域を出芽酵母ゲノム中に創出するために、λファージゲノム48.5 kbをそっくりそのままho遺伝子座位に挿入することを試みた。具体的には、Cas9によるゲノム編集によって、48.5 kbのλDNAを挿入しようとしたが、所期の成果を得られなかった。そこで48.5 kbを相互にオーバーラップした６つの断片に分けてPCRによって調製し、それらを同時にゲノム編集に用いることを試みた。当初、選択を容易にするべく栄養選択マーカーを持たせた形で実施して、６断片が想定された順番通りに挿入されたことを示す結果が得られた。更に、条件を最適化したところ、選択マーカーなしでのλDNAの挿入にも成功したことが示唆された。最終的には、ナノポアシーケンシングを行って、所期の通りにλDNAをゲノム中に挿入できたことを確認した。
更に、導入したDNAメチル化の維持を行うために、維持メチル化酵素DNMT5の人工遺伝子の合成を行い、それらを発現する株の作成を進行中である。
これらのゲノム改変を効率的に進めるために、以前に開発した遺伝子編集プラスミドシリーズを拡張し、３遺伝子座の同時編集も高い効率で進める系を確立した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究の基盤となるゲノム編集技術の整備を行なうとともに、領域としてのメチル化導入を評価するに相応しい人工ゲノム領域の創出に時間を要してしまった。

Strategy for Future Research Activity

研究の基盤となるゲノム編集技術の整備や汎用性の確認に時間を要してしまったが、メチル化の導入・拡張・制限・維持を行うに相応しい人工ゲノム領域の創出ができた。今後は、それぞれのステップに必要な素子の設計・実装を加速して、本研究における挑戦に取り組む。