| Project/Area Number |
22K19292
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今村 博臣 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20422545)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 淳 京都大学, 高等研究院, 教授 (30511894)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | アポトーシス / ATP / CRISPR/Cas9 / CRISPR / バイオセンサー |
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| Outline of Research at the Start |
ATPは細胞内の主要なエネルギー通貨であり、細胞の活動と生存に必要な様々な細胞内のマシナリーを駆動させている。死んだ細胞は細胞内ATPを失うことが古くから知られているが、死細胞でATPが失われる仕組みや生物学的な意義については未解明な点が多い。本研究では、単一細胞内ATP計測・分離技術とCRISPR/Cas9による遺伝子破壊技術を組み合わせることで、細胞死において細胞内ATPを低下させる新たな因子の探索をおこなう。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、単一細胞内ATP計測・分離技術とCRISPR/Cas9による遺伝子破壊技術を組み合わせることで、アポトーシス細胞死において細胞内ATP濃度を低下させる新たな因子の探索を目指した。
前年度までに、非常に大きなFRET効率の変化を示す新規のATPバイオセンサー（ATeam5.13）の開発に成功し、それを向上的に発現するPLB細胞（PLB-ATeam5.13細胞）を作製した。この細胞に全ゲノム遺伝子に対応するsgRNAおよびCas9ヌクレアーゼ遺伝子を保持するレンチウイルスを感染させることによって、各細胞につき遺伝子のいずれか１個がノックアウトされたノックアウト細胞ライブラリーを作製した。アポトーシス時のATP減少に関わる分子がノックアウトされた細胞は、野生型細胞に比べてATPの減少速度が大きく低下すると予想された。そこで、ノックアウト細胞ライボラリーに対してアポトーシスを誘導したのち、蛍光セルソーターで個々の細胞のATP濃度を分析し、他の細胞と比べて高い濃度の細胞内ATP濃度を保持している細胞のみを回収した。回収された細胞に導入されていたsgRN配列をPCRによって増幅し、この配列をもつレンチウイルスを作製したのち、再びPLB-ATeam5.13細胞に感染させた。この実験サイクルを繰り返したが、アポトーシスにおいてATP減少が遅延する細胞集団の濃縮は現時点では確認できていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
予定していたスクリーニングプロセスまでは進んでいるものの、遺伝子の単離には至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
アポトーシス誘導条件、および用いる細胞について再検討をおこなう。
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