| Project/Area Number |
22K19316
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 44:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
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| Research Institution | Konan University |
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Principal Investigator |
武田 鋼二郎 甲南大学, 理工学部, 教授 (90426578)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 淳 京都大学, 高等研究院, 教授 (30511894)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
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| Keywords | ポリリン酸 / ヒト遺伝子 / スクリーニング / ポリリン酸関連タンパク質 / 分裂酵母 / リン酸 / 代謝 / 酵母 / 哺乳類 |
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| Outline of Research at the Start |
リン酸が直鎖状に重合したポリリン酸（polyP）は，全生物が有し，ヒトの健康や農業にも関連性が深い多彩な生理機能が報告されている。しかし，細菌や，真菌などの単細胞真核生物ではpolyP合成酵素が発見されているものの，多細胞生物でははっきりしないのが現状である。本研究はpolyPを大量に合成する分裂酵母の特長を活かして「試験管」のように用い，知見に乏しい多細胞生物のpolyP関連タンパク質の同定に挑戦する。成功すれば，基礎・応用の両面でのインパクトは大きく，特にほ乳類でのこれらの因子群の同定は，制約が多かったpolyP研究の基礎医学面でのブレイクスルーとなることが期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
数十から数百ものリン酸が直鎖状に重合したポリリン酸（polyP)は，全ての生物が有し，多彩な生理機能をもつ生体高分子であり、医学、農学、基礎生物学的にその重要性が注目されている。しかしながら、多細胞生物においてはpolyP合成に関わる因子について知見が乏しいため、分子生物学的な手法でpolyP研究を進めるためには制約があった。本研究は、polyP代謝（合成、分解）に関わる因子が理解されているモデル生物である分裂酵母を用いて、多細胞生物のpolyP合成酵素をはじめとした関連因子の発見に挑戦する。2023年度は、(1) 分裂酵母スクリーニング系の改良、(2) 分裂酵母細胞内のpolyP必須性に関する研究、を実施した。
(1) ヒトpolyP合成酵素スクリーニングのためには、分裂酵母細胞内で形成されたpolyPの可視化が重要である。分裂酵母細胞内のpolyPは、グルタルアルデヒド固定後、DAPIを用いて染色する方法が確立している。しかし、本研究の場合、polyP染色、セルソーターで分取したのち、細胞内の核酸を解析する必要があるため、固定に用いたグルタルアルデヒドの悪影響が懸念される。したがって、2023年度は、DAPIによるpolyP染色の最適化（より緩やかな固定法の条件検討）と、非固定でpolyPを可視化する方法の開発に取り組んだ。また、polyPの細胞毒性を活用したpolyP分解酵素をふくむ関連因子スクリーニングについても引き続き、条件の最適化に取り組み、スクリーニング開始の目処がたった。
(2) 分裂酵母におけるpolyP合成酵素VTC複合体と、リン酸排出因子Xpr1、リン酸取り込み制御因子Pqr1の三者の必須性を明らかとした研究を推進し学術論文を出版した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要に記した(1)-(2)について、それぞれの進捗状況は以下の通りである。
(1) polyPのDAPIによる染色時の細胞固定法に用いるグルタルアルデヒドとTriton X-100の濃度を再検討し、より緩い条件での染色に成功した。polyPライブイメージングのために、大腸菌のpolyP結合タンパク質を利用する方法と、正に荷電した蛍光タンパク質を利用する方法を検討し、後者によって、分裂酵母細胞質に形成されたpolyPを再現性よく可視化できることがわかった。2024年度に、この手法を用いてpolyPを可視化し、スクリーニングを実行する目処がたった。polyP細胞毒性を指標とした、ヒトpolyP関連因子スクリーニングについては、2022年度に判明していた抑制変異の問題の解決に取り組んだ。このスクリーニングでは、大腸菌PPKの発現誘導によって致死となる分裂酵母株に、ヒトcDNAを導入し、致死性を抑制するヒト遺伝子を取得するというものである。予備実験の結果、分裂酵母ゲノムに生じた変異によってPPK発現が誘導されない抑制変異が多数取得されてしまうことが判明している。そのため、2023年度は、抑制変異によって致死性がなくなった株を排除する手法の工夫を行なった。現在、PPK-GFPを使用することで、GFP 陽性かつ増殖可能、という２つの指標によるスクリーニングを行うことで、上記の問題が部分的には解決された状態である。
(2) polyP合成酵素VTC、リン酸排出因子Xpr1、リン酸取り込み抑制因子Pqr1が、細胞質あるいは核のリン酸濃度の致死的な上昇を防止し、リン酸恒常性を維持するために必要であることを示した論文をJBC誌に投稿し、リバイスを経て、出版された。本研究で行うスクリーニングの母体である分裂酵母のリン酸恒常性に関わる研究である。
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| Strategy for Future Research Activity |
polyP合成酵素のスクリーニングに関しては、polyPライブイメージング法が確立し、スクリーニングを実行できる目処がたったため、2024年度は、ヒトcDNAを導入した分裂酵母株（polyP合成不能株）を対象にセルソーターを用いたスクリーニングを行う予定である。polyP細胞毒性を利用した、ヒトpolyP関連因子スクリーニングについては、GFPを用いた指標を導入することで抑制変異を排除したスクリーニングを実行できる目処がたった。したがって、同様に2024年度にヒトcDNAライブラリを用いたスクリーニングを実施する予定である。
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