器官再生における組織横断的な幹細胞活性化を担う細胞種の同定とその実証
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22K19325
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 44:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
深澤 太郎 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (10565774)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
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| Keywords | アフリカツメガエル / 再生 |
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| Outline of Research at the Start |
ツメガエル幼生尾は切断した際に機能的な尾を再形成する高い再生能を示す。申請者らは、ツメガエル幼生尾再生において再生組織中にて発現するインターロイキン11に筋肉・脊索・脊髄の前駆細胞を誘導する機能があることを見出した。再生時における複数組織の前駆細胞の誘導がたった一つの因子に因ることを示す結果であり、これより「各組織の組織幹細胞には組織の別を問わない普遍的な活性化機構がある」という仮説を立てている。本研究ではインターロイキン11の下流因子である新規遺伝子を発現する特定の細胞分画がこの仮想機構の細胞実体であると想定し、この分画が複数組織の幹細胞活性化に関与することを検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)を用い器官再生時の細胞挙動、特に組織幹細胞の挙動について解析を行っている。当研究室の先行研究で、尾再生時に発現するインターロイキン11(il11)に尾を構成する各組織の未分化細胞を誘導する機能があることを見出しており、これより「各組織の幹細胞にはil11により駆動される共通の活性化様式がある」と仮説をおき、この実証を目的に研究を行っている。本申請の研究では、幼生尾再生時の組織幹細胞の活性化に関与する細胞種について解析している。今年度は、(1)これまでにil11ノックダウン時に発現低下する遺伝子のスクリーニングによりツメガエルの特定の白血球分画に発現し幼生尾再生に必須である遺伝子regeneration factors expressed on myeloid (rfem)を同定しており、rfemを発現するこの白血球分画が尾再生に必要であること、この白血球分画のもつ尾再生促進能にrfem発現が必要であることをまとめた論文を出版した（出口ら、Development 2023）。(2)ツメガエル幼生尾再生芽の組織幹細胞濃縮分画(Side Population; SP)を用いて実施したシングルセルRNA-sequencing解析により想定筋幹細胞分画に発現する新規因子を同定し、この因子のノックダウンにより尾再生が阻害されることを見出した（加藤ら、2023分子生物学会）。(3)ツメガエル幼生尾再生不応期に尾再生を阻害する免疫応答について、この現象に関与するケモカイン受容体を同定した（深澤、2023発生生物学会）。なお(1)(2)の一部は課題番号20K21517での実施成果を含む。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)これまでにrfemのノックダウンにより尾再生が阻害されること、rfemはマクロファージ様白血球分画に限局して発現すること、この白血球分画のcolony stimulating factor 1 (csf1)ノックダウンによる分化阻害はrfemノックダウン同様に尾再生を阻害すること、rfemノックダウン個体においてこの白血球で特異的に機能するプロモーターを用いてrfem発現をレスキューすると尾再生能が回復することを見出していた。今年度は、この内容をまとめ投稿していた論文のリバイス実験として、csf1ノックダウン時におけるrfem発現細胞の数を幼生尾切片でのin situ hybridization法により計測し、確かにcsf1ノックダウンにより再生芽付近に存在するrfem発現細胞数が減少することを示した。この内容を追加し論文を出版した（出口ら、Development 2023）。(2)組織幹細胞のもつ薬剤排出能を指標に幹細胞濃縮分画を得る方法であるSP法を用い幼生尾再生芽よりSPを単離、シングルセルRNA-seqを実施しpseudotime解析とRNA velocity解析により疑似細胞分化系列を推定、これによる推定筋幹細胞集団において選択的に発現する因子を同定した。この因子のCrispr/cas9法によるノックダウンは尾再生を阻害することを見出した（加藤ら、2023分子生物学会）。(3)前年度までに、特定のケモカイン受容体遺伝子2種のダブルノックダウンが不応期の再生能を向上させることを見出していた。今年度は、ノックダウン条件の検討の結果前述のケモカイン受容体のうち1種のノックダウンのみでも不応期の再生能が回復することを見出した（深澤、2023発生生物学会）。
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| Strategy for Future Research Activity |
(2)当該因子のノックダウンによる尾再生阻害が、Crispr/cas9法に伴うoff target効果でないことを示すため、ノックダウン個体における当該因子の強制発現を行い表現型がレスキューされるか検討を行う。また、当該因子ノックダウンが尾再生能を低下させる分子的機序を検討するため、当該因子ノックダウンが発現遺伝子プロファイルへ及ぼす影響をRNA-seqにより解析する。(3)再生不応期に関与するケモカイン受容体が１種に絞られたため、この受容体を発現する白血球について不応期への関与の解析を行う。
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Report
(2 results)
Research Products
(10 results)
