Development of antibody-mimetic libraries by CDR grafting
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22K19376
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 47:Pharmaceutical sciences and related fields
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
野中 元裕 京都大学, 医学研究科, 准教授 (70514173)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大石 真也 京都薬科大学, 薬学部, 教授 (80381739)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | Nanobody / 抗体 / CDR / ファージディスプレイ |
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| Outline of Research at the Start |
免疫原性の問題とは、バイオ製剤の投与によって体内で抗薬物抗体が生成されることで、二次無効とよばれる薬効の低下や、予期せぬ副作用が生じることであり、最新の完全ヒト化抗体でもこの問題は解決していない。申請者らは、超可変領域を含む全ての配列がD-アミノ酸で作られた抗体である「鏡像低分子化抗体」に着目し、これまで本抗体が免疫原性をほとんど示さないことを明らかにした。本研究では、ヒット配列が含まれる可能性を向上させた免疫ライブラリーを作製に挑戦することによって、効率的に鏡像低分子化抗体を取得できる方法を開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
バイオ製剤の投与で体内にて抗薬物抗体が生成されることにより、薬効の低下や予期せぬ副作用などの二次無効化現象が生じることがある。これまで申請者らは、全ての配列がD-アミノ酸で作られた「鏡像低分子化抗体」がマウスモデルにおいてほとんど免疫原性を示さないことが明らかにしてきた。一方、これまで申請者らは、ファージディスプレイ法にて用いた人工ランダム配列ライブラリーでは、結合活性を持つ鏡像抗体のヒット配列を効率良く得ることが困難であった。そこで本研究では、マウスに標的D-タンパク質を免疫し、得られた抗体の超可変領域の配列をNanobody/Monobodyへ移植することを目的とした検討を実施した。ヒット配列を効率的に取得できるようになることで、免疫原性を示さないモダリティの実現に近づけることが期待される。
本年度では、ケモカインMCP-1をモデルとして、BALB/cマウスにおいて鏡像MCP-1のフラグメント5種類を用いた免疫を実施した。D-ペプチド単体では抗体価が上がらないことが予想されたため、KLHとのコンジュゲートを用いた。BALB/cマウスに単回腹腔内投与を行った14日後に、血漿を回収し、抗体価を測定した。その結果、C末端領域を含む3種類のD-ペプチドに対しては抗体価の上昇が認められたが、対応するL-ペプチドでは抗体価はほとんど認められなかった。以上の結果から、マウスにおいてD-ペプチドに対する抗体を誘導することが可能であることが明らかとなった。現在、マウスからB細胞を単離し、免疫ライブラリーを作製中であり、今後、マウスIgGのCDR3をNanoody超可変領域に組込んだファージライブラリーを作製する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究にて、申請者らは、D-アミノ酸で構成される鏡像タンパク質はほとんど免疫原性が無いことを示してきた。従って、本研究課題においても、標的分子の鏡像体も同様に免疫が惹起されないことが予想された。しかし、本年度において、適切なキャリア分子とのコンジュゲートを作製することにより、この問題を克服することができた。この成果より、今後のグラフティングのプロセスに円滑に移行することができると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
続いて、重鎖抗体遺伝子のCDR3をNanobody/Monobodyの超可変領域に組込んだT7ファージライブラリーを完成させる。一方、次世代シーケンサーを用いてマウスIgGのCDR3配列のレパトア解析を実施する。DNA配列をアミノ酸配列に置換後、出現頻度順の上位配列において相同配列の有無を確認する。得られたNanobodyおよびMonobodyの免疫ライブラリーを用いて、D-MCP-1を標的として鏡像スクリーニングを実施する。3ラウンド程度のバイオパニング操作で特異的な濃縮が確認されれば、次世代シーケンサーを用いた解析を行う。ヒット配列情報を元にD-NanobodyおよびD-Monobodyを化学合成し、MCP-1分子に対する結合活性を確認する。
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Report
(1 results)
Research Products
(11 results)
