| Project/Area Number |
22K19422
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 49:Pathology, infection/immunology, and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
堀 昌平 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 教授 (50392113)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
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| Keywords | 制御性T細胞 / 細胞分化 / 遺伝子発現制御 / エピゲノム / 転写因子 / T細胞受容体 |
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| Outline of Research at the Start |
制御性T細胞は、固有のエピゲノムを備えることで炎症などの細胞外環境からの様々な擾乱に対しても免疫抑制機能を安定的に発現し、様々な病的免疫応答を頑健に制御する。本研究では、制御性T細胞固有のエピゲノムがどのようなメカニズムにより形成されるのか、炎症環境下ではエピゲノムがリプログラムされヘルパーT細胞へ分化転換し得るのか、という2つの研究課題の解明に取り組む。近年、制御性T細胞を用いた免疫疾患の細胞療法が注目され世界的に研究が進んでいる。本研究は制御性T細胞療法への応用と制御性T細胞エピゲノムを操作する化合物を探索する創薬研究への発展が期待され、挑戦的研究として意義がある。
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| Outline of Annual Research Achievements |
1．TCRシグナルによるTET依存的TSDR脱メチル化メカニズムの解明：これまでに、iTreg分化系を用い、TCR-mTORC1シグナルがDNA脱メチル化酵素TET2/3のタンパク質レベルでの発現を促進することによりTreg固有のエピゲノム（Foxp3遺伝子座のTSDR領域のDNA脱メチル化）を誘導することを見いだした。本年度、TCR-mTORC1シグナルによるTET2/3タンパク質発現制御機構を解析し、TET2/3タンパク質の分解を抑制するのではなく、mRNAの翻訳を促進することを明らかにした。また、CD4-Cre Tg. Tet2 flox. Tet3 floxマウスから単離したナイーブCD4 T細胞を用いることで、TET2とTET3の総量に応じてTSDRの脱メチル化を促進することを明らかにした。
2．Tregエピゲノムレポーターマウスの作製・解析：昨年度、Snrpnプロモーターを用いたTSDRレポーターマウスを作製したが、GFP発現が見られなかった。そこで、Tregでも作動するSnrpn以外の刷り込み遺伝子のプロモーターを探索した結果、Kcnq1ot1遺伝子がTregで高く発現し、そのプロモーター領域がTregでopenになっていることがわかった。そこで、この遺伝子に着目し、そのプロモーターが実際にTregで作動するか、Treg細胞においてレトロウイルスベクターを用いたレポーターアッセイを行った。その結果、期待に反して、Kcnq1ot1プロモーターはSnrprnプロモーター同様、TSDRの有無に関わらずレポーター遺伝子（GFP）の発現をdriveしなかったことから、このプロモーターもレポーターマウス作製に用いるプロモーターとしては不適切であると判断された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TCRシグナルによるTET依存的TSDR脱メチル化メカニズムの解明に関しては、TCR-mTORC1シグナルがTET2とTET3の発現を翻訳レベルで促進することを明確にでき、現在論文作成を進めている。Tregエピゲノムレポーターマウスの作製・解析に関しては、適切な刷り込み遺伝子のプロモーターを探索している段階であるが、これまでのところTregで働くプロモーターは見つけられていない。明確な結論が得られたという点ではこのプロジェクトを前進させることができたが、当初の目的を果たすことができず、引き続きプロモーター探索を続ける。以上、本研究は全体としてはおおむね順調に進展していると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
TCRシグナルによるTET依存的TSDR脱メチル化メカニズムの解明に関しては、論文化を進める。また、in vitro分化系において全ゲノムレベルでのDNAメチル化解析（EM-seq）とATAC-seq解析を行い、強く持続的なTCRシグナルに依存して脱メチル化されるゲノム領域を同定する。そして、その領域にエンリッチしている転写因子結合モチーフを検索することにより、TSDRを含む脱メチル化領域にTET2/3をリクルートする転写因子を同定し機能解析を進める。また、in vitro系を用いてこれまで明らかにしたTCR-mTORC1-TET2/3依存的TSDR脱メチル化メカニズムが生体内におけるTreg分化においても働いているか、T細胞特異的Raptor欠損マウスを用いて詳細に検討を進める。Tregエピゲノムレポーターマウスの作製・解析に関しては、引き続きプロモーター探索を続ける。Foxp3プロモーターに着目して解析を進める。
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