| Project/Area Number |
22K19426
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 49:Pathology, infection/immunology, and related fields
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
土屋 晃介 金沢大学, がん進展制御研究所, 准教授 (50437216)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
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| Keywords | パイロトーシス / ガスダーミン / 細菌プロテアーゼ / 細菌 / プロテアーゼ |
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| Outline of Research at the Start |
パイロトーシスは、ネクローシス様の形態変化を伴うプログラム細胞死の一種であり、炎症誘導や感染防御に関わる。その誘導にはプロテアーゼによるガスダーミン(GSDM) ファミリー分子の成熟化が必須である。本研究は、細菌・真菌由来プロテアーゼがGSDMを成熟化する可能性に直目している。細菌・真菌プロテアーゼによるGSDM依存的なパイロトーシス誘導は、宿主の感染抵抗性や炎症病態に影響を与えることが想定される。そこで本研究では、GSDM分子を成熟化させる細菌/真菌由来プロテアーゼを探索し、それらによって誘導されるパイロトーシスが感染病態に与える影響を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
パイロトーシスの誘導には細胞質蛋白であるガスダーミン(GSDM) ファミリー分子の成熟化が必須であり、ヒトでは5種類（GSDMA - GSDME）、マウスでは9種類のGSDMが存在している。完全長GSDMは未熟型であり活性を示さないが、特定のプロテアーゼによって切断されることで成熟化する。現在までにGSDMを成熟化させる宿主プロテアーゼが数種類同定されている。一方、細菌/真菌由来プロテアーゼがGSDMを切断してパイロトーシスを正または負に制御する可能性も考えられる。しかし、これまでにそのような報告例は少ない。本研究では、GSDM分子を成熟化・不活化する細菌/真菌由来プロテアーゼを探索する。さらに、そのようなパイロトーシスの制御が感染病態に与える影響を明らかにする。今年度、前年までに培養細胞でのパイロトーシス誘導活性を指標にしたスクリーニングにおいてヒトGSDMDを活性化することが判明していた緑膿菌由来プロテアーゼであるAprAとMucDについて、リコンビナント蛋白を用いて詳細な解析を行なった。その結果、AprAはヒトGSDMDを直接切断せず、MucDはヒトGSDMDのN末端側ドメインを切断することがわかった。ヒトGSDMDがN末端側ドメイン内で切断されると活性化されずむしろ不活化されてしまうため、AprAとMucDのパイロトーシス誘導活性は直接的なヒトGSDMDの活性化ではなく他の分子が関わる非直接的な機序によるものだと考えられた。いずれにしても、MucDによるヒトGSDMDの不活化およびAprAとMucDによる非直接的なパイロトーシス誘導は興味深い新規知見となる。一方、スクリーニングによりヒトGSDMDを切断する新たな細菌プロテアーゼを発見した。エロモナス属細菌のセリンプロテアーゼ（ASP）がヒトGSDMDを活性化させる位置で切断することを示唆する結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年までにヒトGSDMDを活性化することが判明していた緑膿菌由来プロテアーゼのAprAとMucDについて詳細な解析を行い、その機序について概ねの理解が得られた。さらに、同時に進めていたスクリーニングにより新たなGSDMD切断細菌プロテアーゼを発見できた。これらの理由から、本研究は順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
エロモナス属細菌のセリンプロテアーゼ（ASP）がヒトGSDMDを活性化させてパイロトーシスを誘導する可能性をさらに詳細に検討する。エロモナスのASP欠損株を用いて、宿主マクロファージにおいてASP依存的な細胞死の亢進およびGSDMD切断が起こるか調べる。また、GSDMD欠損マクロファージにエロモナスを感染させることで、細胞死がASP依存的なパイロトーシスであるか確認する。さらに、基質となるGSDMファミリー蛋白を簡易に調製できる方法を開発する。我々は、無細胞の転写・翻訳系を用いてリコンビナント蛋白を作製する方法を確立している。これをGSDMファミリー蛋白の調製にも応用する。これにより、夾雑物が少なくより解析に適したGSDMファミリー蛋白を作製できると期待される。また、各蛋白のN末端とC末端にタグを付加し、WBやELISAに利用することでさらに解析効率を上げる。
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