| Project/Area Number |
22K19441
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 49:Pathology, infection/immunology, and related fields
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
金子 修 長崎大学, 熱帯医学研究所, 教授 (50325370)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | マラリア / 培養 / Plasmodium vivax / Plasmodium cynomolgi / Plasmodium knowlesi |
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| Outline of Research at the Start |
三日熱マラリア原虫はヒトの幼若赤血球に侵入し増殖するが、大量のヒト幼若赤血球をルーチンに入手することは困難であるため実用的な培養系が存在しない。そこで、熱帯熱マラリア原虫のヒト成熟赤血球を認識するリガンドを三日熱マラリア原虫に導入することで、ヒト成熟赤血球に侵入し、発育することができる三日熱マラリア原虫の作出を目指す。この原虫を用いることで、本原虫の実用的な培養系が確立できると考える。
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| Outline of Annual Research Achievements |
三日熱マラリア原虫はヒトの幼若赤血球に侵入し増殖するが、大量のヒト幼若赤血球をルーチンに入手することは困難であるため実用的な培養系が存在しない。そこで、熱帯熱マラリア原虫のヒト成熟赤血球を認識するリガンドを三日熱マラリア原虫に導入することで、ヒト成熟赤血球に侵入し、発育することができる三日熱マラリア原虫の作出を目指す。この原虫を用いることで、本原虫の実用的な培養系が確立できると考える。次年度はP. cynomolgiを用いて作製するリガンド発現プラスミドの評価とP. cynomolgiにおける表現型を検討することを計画した。
初年度にP. cynomolgiへのEBA175発現プラスミドの導入を開始したが、3か月たっても薬剤耐性原虫が出現しなかった。そのため、エピソームによる遺伝子導入に加えて、CRISPR/Cas9遺伝子編集なども用いた複数のプロトコールにより遺伝子導入実験を繰り返した。しかし、薬剤耐性株を得ることが出来なかった。P. knowlesiへの遺伝子導入は問題なく行われているため、P. cynomolgi、もしくは、我々の保有するP. cynomolgi株に固有の問題と思われる。また、我々の保有するP. cynomolgiは我々がin vitroで維持しているP. knowlesiや熱帯熱マラリア原虫よりも増殖速度が遅く、そのため、遺伝子導入の成功の有無の評価をするのに時間を要し、本年度中に組換えP. cynomolgi原虫を得ることができなかった。一方、初年度に確立したP. cynomolgiに最適化した培養培地を用い、複数のP. knowlesi感染ヒト患者の血液から、P. knowlesi in vitro培養株の樹立を試みたところ、ヒト株で樹立に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
次年度に計画するP. vivaxへの遺伝子導入を行うためには、P. cynomolgiへの遺伝子導入を再現性良く安定して実施できるようになる必要があるが、その最適化に時間を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
P. cynomolgiへの再現性の高い遺伝子導入プロトコールの確立を優先して検討する。ルシフェラーゼ発現プラスミドを用いて、赤血球へのプレロード法、ロンザ社4D-Nucleofectorシステムおよびロンザ社Nucleofector 2b デバイスを用いて成熟分裂体期原虫に遺伝子導入する方法等について、条件を振って導入効率を検討することで、P. cynomolgiでの遺伝子導入法の最適化を進める。
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